Análise de carboidratos em forrageiras

Por Letícia Sayuri Suzuki, Pesquisadora da Embrapa Gado de Leite

O teor de carboidratos solúveis de forrageiras é um conhecimento que tem sido bastante demandado pois essas moléculas representam uma proporção importante na dieta de ruminantes e outras categorias animais, além de estarem associadas à capacidade de rebrota da forrageira após o corte e à qualidade da fermentação no processo de ensilagem.

No entanto, a partir do momento que a amostra da forrageira chega ao laboratório para ser analisada, a literatura diverge em relação a metodologia a ser utilizada. A verdade é que não existe uma metodologia ideal. A adoção de um método de determinação de carboidratos leva em conta a fração de carboidratos que importa saber para se obter as respostas procuradas para o material e qual o desvio aceitável para essa resposta. A isso deve ser somado a estrutura do laboratório, recursos disponíveis e o propósito do ensaio (selecionar materiais para fermentação da silagem, formulação de dietas, etc.).

O teor de carboidratos solúveis de forrageiras são influenciados por vários fatores como condições climáticas, manejo, genótipo, proporções relativas de folhas e colmos, estádio de crescimento, além do processo de secagem e moagem da amostra (caso não seja utilizado material verde). Portanto, dentro de um mesmo genótipo, pode haver variabilidade nas características da amostra que irão influenciar os resultados. Por isso é muito importante que todas essas informações sejam anotadas para se discutir os resultados obtidos.

Frações de carboidratos

A primeira observação a ser realizada é qual a fração de carboidratos que a metodologia utilizada no estudo determina, pois isso pode levar a resultados diferentes. É comum haver confusão entre carboidratos solúveis e carboidratos não-estruturais. Os carboidratos solúveis, prontamente fermentados no rúmen, incluem os monossacarídeos como a glicose e a frutose e dissacarídeos como a sacarose. Os carboidratos não-estruturais incluem, além dos carboidratos solúveis, o amido, um polímero insolúvel que possui taxas intermediárias de digestão no rúmen e encontra-se associado ao conteúdo celular, sendo o principal carboidrato de reserva das leguminosas temperadas. Ainda, os carboidratos podem ser classificados como carboidratos não-fibrosos, uma fração muito heterogênea que inclui qualquer carboidrato solúvel em detergente neutro, entre eles: carboidratos não-estruturais, associados ao conteúdo celular: açúcares, amido; fibra solúvel em detergente neutro (FSDN): substâncias pécticas, frutosanas e beta-glucanas, além de ácidos orgânicos e compostos associados.

Extração das amostras

A extração das amostras pode ser realizada em água, etanol, ácido ou por meio de enzimas e essas metodologias influenciam diretamente a fração de açúcares que se deseja quantificar. Tanto a água como o álcool são capazes de extrair monossacarídeos, dissacarídeos e oligossacarídeos. Mas a água também pode extrair alguns polissacarídeos, contanto que sejam solúveis em água. Não é o caso do amido. A extração com ácido, quando adaptada para a hidrólise de sacarose (que hidrolisa mais rapidamente do que outros dissacarídeos), também pode hidrolisar oligossacarídeos como estaquiose e rafinose. A extração completa do amido pode ser realizada com a utilização de enzimas (amilases) e existem kits de reagentes disponíveis para que se possa executar tanto a extração do amido como a sua posterior determinação por método colorimétrico. A hidrólise ácida da amostra pode extrair o amido, mas sem garantia de hidrólise completa, como ocorre com o uso de amilases. No entanto, o uso de enzimas torna a análise mais cara e pode ocorrer também de ser mais demorada.

Métodos de determinação de carboidratos

Os métodos colorimétricos e a análise por cromatografia, principalmente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são comumente utilizados para quantificar carboidratos solúveis de gramíneas. Cada um apresenta vantagens e desvantagens. Como as características da amostra podem influenciar bastante os resultados, havendo possibilidade, é interessante que seja feito inicialmente um estudo com as mesmas amostras para comparar os dois métodos, para depois se optar pelo que oferece melhor custo-benefício para cumprir com os objetivos da análise.

Os ensaios colorimétricos possuem a vantagem de serem de baixo custo, em relação aos reagentes e equipamentos utilizados. Também são relativamente rápidos. Entretanto, são menos específicos que os ensaios que utilizam extração enzimática ou cromatografia. Resumidamente, a amostra é extraída (isto é, os carboidratos são solubilizados em um meio líquido, podendo haver também a hidrólise de moléculas maiores como dissacarídeos em monossacarídeos) e depois passa por reações químicas (que variam de acordo com o método colorimétrico empregado) que convertem os açúcares extraídos em produtos coloridos. A solução com os produtos coloridos é lida em espectrofotômetro com o comprimento de onda adequado e, fazendo a correlação com a leitura de um padrão de carboidrato, chega-se ao teor de carboidratos da amostra. Nas referências desse artigo são citadas publicações que detalham alguns métodos, como o fenol-sulfúrico, Teles e Somogyi-Nelson (Maldonade et al., 2013; Silva e Queiroz, 2006; Zhao et al., 2010).

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC), tem sido bastante empregada nos últimos anos. Trata-se de uma análise onde cada molécula pode ser determinada individualmente e com exatidão. No entanto, geralmente é uma análise mais demorada, além de ser de custo mais alto, em relação aos reagentes e equipamentos empregados. Como é uma técnica que determina cada molécula individualmente (com base em padrões de glicose, frutose, entre outros), a comparação com resultados da literatura expressados, por exemplo, em termos de carboidratos solúveis totais, requer que sejam somados todos os valores dos açúcares determinados individualmente pela análise por HPLC. Nas referências desse artigo são citadas publicações que detalham algumas análises realizadas utilizando essa técnica (Hall, 2014; Longland et al., 2012; McCleary et al., 2019).

Todas as metodologias tem em comum a necessidade de pessoal bem treinado para executá-las. É importante anotar todos os detalhes da análise. No laboratório, atenção deve ser dada aos reagentes utilizados: marca, data de validade e qualquer outro fator que possa gerar alguma variação no resultado, a fim de se diminuir as interferências. A descrição da metodologia (que deve compor um Procedimento Operacional Padrão) deve ser o mais detalhada possível, a fim de uniformizar o trabalho e minimizar erros.

A adoção rotineira de uma metodologia depende da união desses cuidados e conhecimentos, além da experimentação, adaptação do método às características do material a ser avaliado, avaliação de custos e facilidade de execução, de modo que atenda aos objetivos da análise.

Referências Bibliográficas

HALL, M. B. Selection of an empirical detection method for determination of water-soluble carbohydrates in feedstuffs for application in ruminant nutrition. Animal Feed Science and Technology, Amsterdam, v. 198, p. 28-37, 2014.

LONGLAND, A.C.; DHANOA, M.S.; HARRIS, P.A. Comparison of a colorimetric and a high-performance liquid chromatography method for the determination of fructan in pasture grasses for horses. Science of Food and Agriculture; v. 92, ed. 9, p. 1878-1885, 2012.

MALDONADE, I.R.; CARVALHO, P.G.B.; FERREIRA, N.A.; MOULIN, B.S.F. Protocolo para determinação de açúcares redutores pelo método de Somogyi-Nelson. Comunicado Técnico 86, Embrapa Hortaliças. 4 p. 2013.

MCCLEARY, B. V., CHARMIER, L. M. J., MCKIE, V. A., CIARA MCLOUGHLIN, C. e ROGOWSKI, A. Determination of Fructan (Inulin, FOS, Levan, and Branched Fructan) in Animal Food (Animal Feed, Pet Food, and Ingredients): Single-Laboratory Validation, First Action 2018.07. Journal of AOAC International, v. 102, ed.3, 883. 2019.

SILVA, D.J.; QUEIROZ, A.C. Análise de alimentos. Métodos químicos e biológicos. 3ª edição. Editora UFV, Universidade Federal de Viçosa. 235 p., 2006.

ZHAO, D.; McKOWN, C.T.; STARKS, P.J.; KINDIGER, B.K. Rapid Analysis of Nonstructural Carbohydrate Components in Grass Forage Using Microplate Enzymatic Assays. Crop Science, v. 50, p.1537-1545, 2010.