Principais cuidados e erros para análise Brix e proteína do soro

As bezerras nascem com concentrações indetectáveis de anticorpos (agamaglobilinêmicas), já que a placenta bovina sinepiteliocorial não permite a transferência passiva de imunoglobulinas da mãe ao feto durante a gestação.

Desta forma, a transferência da imunidade passiva (TIP) via colostro é fundamental para a proteção das bezerras nos primeiros meses de vida, além de trazer outros benefícios em curto e longo prazo. O manejo de colostro pode ser traduzido em menores índices de morbidade e mortalidade, além de maior ganho de peso, desenvolvimento e produção de leite.

Ferramentas que auxiliam na avaliação da transferência de imunidade passiva são fundamentais para checar o sucesso do manejo de colostro e a detecção da falha na transferência de imunidade passiva (FTIP). A FTIP não é uma doença, mas é o principal fator de risco para as diarreia, onfalopatia, colisepse, artrite séptica e broncopneumonia.

A dosagem de IgG pelo teste imunoenzimático ou imunodifusão radial (RID) tem sido apresentada como padrão-ouro para avaliação da transferência de imunidade passiva em bezerras. Bezerras bem colostradas precisam apresentar a concentração mínima de 1.000 mg/dL de IgG no soro após a ingestão do colostro. Teores de IgG abaixo deste ponto de corte são consideradas positivas para FTIP.

As desvantagens no uso destes testes laboratoriais são preço,  demora de 24h a 36h para a liberação dos resultados, além da necessidade de mão de obra especializada, equipamentos e estrutura laboratorial. Devido a isto, o refratômetro de proteína sérica e o refratômetro de BRIX são indicados para uso a campo, por sua praticidade e velocidade na obtenção de resultados. Muitas pessoas confundem estes dois refratômetros, já que ambos são refratômetros ópticos e visualmente muito parecidos (Figura 1).

Porém, os aparelhos medem biomarcadores diferentes. O refratômetro de PROTEÍNA tem uma escala que vai de 0 a 12 g/dL. O refratômetro de BRIX possui escala de 0 a 30%, e determina a quantidade de sólidos totais (Figura 2).

A avaliação da transferência de imunidade passiva deve ser feita de preferência entre 48h e 72 horas de vida (no máximo até 7 dias). O ponto de corte para proteína total igual a 5,5 g/dL é adotado para a detecção da falha na transferência de imunidade passiva. Já o ponto de corte para o BRIX é 8,4%. Bezerras que apresentam valores menores que os pontos de corte são consideradas positivas para falha na transferência de imunidade passiva.

A análise da eficácia da colostragem no sistema de criação de bezerras pode ser avaliada por meio de padrões apresentados pela Godden e colaboradores (2019) (Tabela 1).

No campo temos observado muitas dúvidas em relação ao processo de avaliação da transferência de imunidade passiva, o qual se realizado de forma inadequada, pode gerar uma série de problemas e erros de interpretação dos resultados. Sendo assim, nós preparamos um manual com o passo a passo desde a coleta até a leitura dos resultados nos refratômetros.

• Passo 1 - Coleta do sangue

Primeiramente, fazer a limpeza com álcool 70% na região da artéria jugular, local onde será feita a punção do vaso. A coleta deve ser feita em tubo seco (sem anticoagulante).

Os tubos mais indicados são o de tampa vermelha e amarela, ambos possuem ativador de coágulo (sílica) jateado em sua parede, fazendo com que o processo de coagulação da amostra seja acelerado, o que facilita nas rotinas da fazenda.

A diferença entre os dois tubos é que o de tampa amarela, além do ativador de coágulo possui um gel separador para obtenção de um soro com melhor qualidade (Figura 3). Usar outros tubos que não sejam próprios para coleta de sangue podem induzir erros na análise da amostra.

A coleta pelo método convencional (com agulha e seringa), em seguida, o sangue deve ser transferido para o tubo seco imediatamente, deixando o sangue escorrer pela parede do tubo, evitando alterações na amostra (Figura 4).

A coleta de sangue também pode ser feita utilizando sistema à vácuo (Figura 5), com auxílio de um adaptador denominado “canhão”, o qual é acoplada a uma agulha e tubos de coleta específicos. Neste sistema, o sangue flui diretamente para o interior do tubo, sem contato com o meio externo, permitindo assim uma coleta de melhor qualidade (Figura 6).

• Passo 2- Separação do soro

O soro pode ser obtido por separação manual ou mecânica. Independente da escolha da técnica, a amostra precisa coagular. A utilização do banho-maria ou estufas a 37ºC acelera o processo de coagulação.

Na separação manual, a amostra deve ficar descansando em temperatura ambiente (20 ºC a 26ºC) em posição vertical para dessorar. Na forma mecânica, a amostra deve ser centrifugada em uma velocidade de 2500xg por 15-20 min (Figura 7). A figura 8 demonstra as características visuais de um soro sanguíneo ideal para análise no refratômetro.

• Passo 3- Leitura das amostras do soro sanguíneo nos refratômetros

Antes de realizar a leitura das amostras, deve-se calibrar o aparelho. Erros por falha de calibração dos refratômetros são muito comuns. A calibração pode ser feita pela adição de uma gota de água destilada sobre a lente do refratômetro.

O valor no BRIX (%) deve ser igual a zero. Se estiver usando um refratômetro de proteínas, a coluna marcada entre a área azul e branca deve estar sobre o “W” (W= Water, que significa “água” em português) (Figura 9).

Caso os resultados estejam acima ou abaixo dos valores ideais na etapa de calibração, deve-se realizar o ajuste manual com uma chave que é enviada junto com o aparelho após a compra (Figura 10).

Após a calibração, inicia-se a leitura das amostras de soro sanguíneo. Para tanto, dispensar o soro com o auxílio de uma pipeta ou conta gotas na lente do refratômetro (Figura 11). 

A leitura deve ser realizada observando-se as escalas dos refratômetros de proteína total ou refratômetro de BRIX. O Brix (%) ou valor da proteína total (g/dL) estará marcado entre a área azul e branca indicada no visor (Figura 12).

• Passo 4- Interpretação dos resultados e principais erros de leitura

É importante ressaltar que uma das fases mais críticas para a obtenção de uma boa amostra está entre as etapas de coleta e separação do soro sanguíneo. Infelizmente erros nos resultados são comuns nas fazendas, devido à falta de cuidado nas etapas de coleta e acondicionamento das amostras, o que gera altos índices de hemólise.

A hemólise é a ruptura das hemácias (glóbulos vermelhos) com a liberação de uma substância intracelular denominada hemoglobina, o que resulta em soro com aparência avermelhada (Figura 13).

A hemoglobina é um sólido sanguíneo assim como as proteínas, indicando um falso positivo em ambos os refratômetros, o que pode trazer interpretações equivocadas por parte da equipe da bezerreira.

Para evitar a hemólise deve-se ter cuidado nas etapas de coleta das amostras, evitando punções repetidas ou puxar o êmbolo da seringa diversas vezes. Uma ferramenta bastante interessante apresentada neste artigo é o uso do sistema de coleta à vácuo, o qual pode diminuir o risco de hemólise.

Outros cuidados para prevenir a hemólise das amostras estão destacados abaixo:

• Deve-se evitar a agitação excessiva das amostras;
• Nunca reutilizar tubos de coleta, já que são materiais descartáveis;
• Evitar tempo de armazenamento prolongado (acima de 24h);
• Evitar a manutenção das amostras em temperaturas muito frias até congelantes (<2ºC);
• Cuidado com dias quentes, nunca deixe a amostra descansando sob bancadas e pias, em contato com o sol.

O conhecimento dos fatores que podem induzir a hemólise, assim como implementar procedimentos de coleta padronizados, são extremamente importantes para minimizar as taxas de hemólise e melhorar a confiabilidade dos resultados do brix, e consequentemente melhorar a avaliação da transferência de imunidade passiva do rebanho.

O investimento no sistema de coleta à vácuo estimado varia entre R$ 2,00 a 5,00, o que não é oneroso para a realização de um teste tão importante para o sistema de produção de bezerras. O preço de uma centrifuga para tubos pode ser encontrada por valores entre R$1500,00 a 2000,00, o que acelera o processo de análise em médias e grandes rebanhos.

A confiabilidade dos resultados obtidos por ambos refratômetros Brix e de proteína dependem da execução de todas as etapas com cuidado, cautela e sem pressa. É imprescindível e necessário a compra de materiais adequados para um resultado final confiável, que realmente pode ser usado para a gestão do manejo de colostro dentro dos sistemas de criação de bezerras.

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Referências

LOMBARD, J. et al. Consensus recommendations on calf- and herd-level passive immunity in dairy calves in the United States. Journal of Dairy Science. Journal of Dairy Science, v.103, p.7611-7624, 2020.

BUCZINSKI, S., VANDEWEERD, J.M. Diagnostic accuracy of refractometry for assessing bovine colostrum quality: A systematic review and meta-analysis. Journal of Dairy Science, v. 99, p. 7381–7394, 2016.

DEELEN, S.M., OLLIVETT, T.L., HAINES, D.M., LESLIE, K.E. Evaluation of a Brix refractometer to estimate sérum immunoglobulin G concentration in neonatal dairy calves. Journal of Dairy Science, v.97, p.3838–3844, 2014.

HERNANDEZ, D. et al. Brix refractometry in serum as a measure of failure of passive transfer compared to measured immunoglobulin g and total protein by refractometry in serum from dairy calves. The Veterinary Journal, v.211, p.82-87, 2016.

HEIREMAN, L. et al. Causes, consequences and management of sample hemolysis in the clinical laboratory. Clinical Biochemistry, v.50, p.1317-1322, 2017.

GODDEN, S.M., LOMBARD J.E., WOOLUMS A.R. Colostrum Management for Dairy Calves. Vet Clinics Food Animal, v.35, p. 535-556, 2019.

WILM, J. et al. Technical note: Serum total protein and immunoglobulin G concentrations in neonatal dairy calves over the first 10 days of age. Journal of Dairy Science, v.101, p.6430-6436, 2018