A importância do método baseado na reação com formol na determinação de proteínas lácteas

As proteínas lácteas ocorrem em dois grupos majoritários: as caseínas (80% do nitrogênio total) e as soroproteínas (20% do nitrogênio total), com distribuição dependente de fatores intrínsecos e extrínsecos, como genética, alimentação do rebanho, época do ano etc.

As caseínas possuem como função biológica precípua o transporte de cálcio e fosfato para o neonato. Aproximadamente 95% das caseínas apresentam-se na forma de partículas coloidais, denominadas micelas, que estão implicadas com a estabilidade térmica do leite (Goff, 2009).

As proteínas do soro, neste estudo consideradas aquelas provenientes da coagulação enzimática do leite, são globulares, apresentando dois constituintes principais (α-lactalbumina e β-lactoglobulina), exibindo alta hidrofobicidade e baixa capacidade de ligação com o cálcio, quando comparadas às caseínas. A β-lactoglobulina corresponde a fração predominante no soro (38% a 45%), apresentando resistência à ação de ácidos e enzimas proteolíticas presentes no estômago, além de ser importante peptídeo carreador de retinol (provitamina A) (de Wit, 1998). A α-lactalbumina (correspondente a 15% a 20% do soro) é rica em aminoácidos como lisina, leucina, treonina, cistina, possui capacidade de ligação com minerais, como cálcio e zinco além de ser precursor da biossíntese da lactose (Markus et al., 2002; Lönnerdal, 2003).

Importância econômica das proteínas lácteas

As proteínas lácteas representam o componente de maior valor para a industrialização laticinista. A lucratividade das indústrias depende do rendimento fornecido pela riqueza composicional, a exemplo, da fabricação de queijos e eficiência da transformação do leite em coprodutos como leite concentrado.

O leite concentrado a partir de desidratação ou concentração por membranas como ultrafiltração é um estratégico macroingrediente na fabricação de produtos lácteos por apresentar elevado teor proteico e representar versatilidade no balanço de fórmulas.

As propriedades sensoriais, nutricionais e de textura, dos principais produtos lácteos, como bebidas lácteas, queijo e iogurte derivam das propriedades das caseínas (de Kruif et al., 2012).

A estabilidade térmica conferida pelas caseínas do leite, viabiliza tratamentos de alta temperatura e produção de inúmeros produtos lácteos esterilizados com longa vida de prateleira (Singh, 2004).

Segundo o MilkPoint Mercado (2023) a geração de soro de leite derivado da produção de queijos no Brasil é de nove bilhões litros/ano, fixando-se no cenário nacional como importante fonte de proteínas solúveis para aplicação em derivados lácteos (Zavereze et al., 2010).

Determinação de proteínas lácteas

Em um cenário laticinista cada vez mais competitivo, o controle de qualidade e a caracterização de matérias primas são cada vez mais exigidos, com aplicação de ferramentas analíticas equivalentes aos seus respectivos métodos de referência.

A determinação das proteínas lácteas tem sido tradicionalmente realizada por método tradicional de Kjeldahl e nos laboratórios de rotina industrial por métodos espectrofotométricos automáticos (MilkoScan®, Bruker® e Perkin Elmer®), todavia, o tempo resposta das análises via Kjeldahl e o custo elevado da instrumentação para os métodos automáticos, dificulta a aplicação em boa parte dos laticínios brasileiros (Silva e Carvalho, 1993).

O método do formol é baseado na medição de prótons liberados pela reação do formaldeido com os grupos amino das cadeias laterais das proteínas lácteas, fixando-se como método indireto de fácil execução para determinação de proteínas (Richmond e Miller, 1906; Wolshoon, Vargas, 1977).  A seguir, tem-se a representação esquemática do método:

Figura 1. Método de determinação de proteína de leite cru baseado na reação com formol

Fonte: elaborado pelos autores (2023)

Expressão dos resultados de proteína em leite cru pelo método baseado na reação com formol:

TP: Teor de proteína total  (g/100g)

V2: mL de solução de hidróxido de sódio gasto na 2ª titulação;

FAF: Fator acidez do formol (volume em mL consumido na titulação do formol);

fc: Fator de conversão formol versus proteína de leite cru (1,74)

TP = (V2 – FAF) * fc

Steinegger (1905) definiu o valor aldeído como a diferença entre a acidez original do leite e acidez após adição de formaldeído 40%.

Pyne (1956) encontrou melhor acuracidade do método mediante adição de oxalato de potássio previamente a titulação com formol, no intuito de eliminar o efeito de precipitação de fosfatos coloidais presentes na amostra e mitigar a palidez do conteúdo amostral, favorecendo a determinação do ponto de viragem da titulação. O mesmo autor estabeleceu o valor de 1,74 como fator de conversão em mililitros de hidróxido de sódio para percentual de proteína no leite.

Wolfchoon e Vargas (1977) estudaram a aplicação do método de formol para determinação do teor de proteína em leite cru e pasteurizado, encontrando alto índice de correlação em comparação com método referência Kjeldahl.

Para Oliveira, Segheto e Furtado (2006), o método de formol é de grande relevância por apresentar baixo custo, rápida execução e aplicabilidade à realidade das indústrias de laticínios.

Nascimento (2023) estudou a aplicação do método de formol para determinação do teor de proteínas em leite concentrado por ultrafiltração (12% a 18% de proteínas) a partir da adaptação do método proposto por Wolfchoon e Vargas (1977), não encontrando diferença significativa dos teores de proteína determinados pelo método referência de Kjeldahl e formol. O fator determinado para conversão do número de mililitros de NaOH 0,1 mol/L em porcentagem de proteína de leite concentrado foi 1,8932. A seguir a representação esquemática do método adaptado:

Figura 2. Método de determinação de proteína de leite concentrado baseado na reação com formol

               Fonte: elaborado pelos autores (2023)

Expressão dos resultados de proteína em leite concentrado pelo método baseado na reação com formol:

TP: Teor de proteína total  (g/100g)

V2: mL de solução de hidróxido de sódio gasto na 2ª titulação.

5: Fator de diluição

FAF: Fator acidez do formol (volume em mL consumido na titulação do formol);

fc: Fator de conversão formol versus proteína de leite cru (1,8932)

TP = (V2*5 – FAF) * fc

No âmbito do controle de qualidade na indústria de alimentos, a busca por métodos analíticos sofisticados e com alta exatidão é fundamental para expandir a verificação da segurança e da conformidade dos ingredientes, matérias-primas, produtos em processo e produtos acabados para o consumo humano.

A adoção de métodos instrumentais representa um avanço expressivo, caracterizado pela seletividade, acurácia e capacidade destes métodos para processamento de diversas amostras. No entanto, é necessário reconhecer que os métodos analíticos convencionais, baseados em princípios químicos clássicos, como doseamentos e titulações, continuam a desempenhar um papel fundamental nas análises de rotina dos alimentos.

 Este valor atribuído aos métodos clássicos se deve, em grande medida, à praticidade, ao custo acessível e à familiaridade que os protocolos analíticos exibem e conferem junto à equipe de laboratoristas, garantindo uma implementação eficiente e confiável no contexto das operações diárias de controle de qualidade. Assim, a complementaridade entre as inovações analíticas e as abordagens laboratoriais tradicionais contribuí para os esforços de controle e segurança dos alimentos.

Referências bibliográficas

DALGLEISH, D. G. On the structural models of bovine casein micelles – Review and possible improvements. Soft Matter, v.7, 2011, p. 2265–2272

DE KRUIF, C. G. HOLT, C. Casein Micelle Structure, Functions and Interactions Advanced Dairy Chemistry, Volume 1, Proteins, Third Edition A, Chapter 5 Ed. P. F. Fox and P. L. H. McSweeney Kluwer Academic, New York, 2003

DE WIT, J. N. Nutritional and functional characteristics if whey proteins in foods products. Journal of Dairy Science, United States, v. 81, Disponível em:https://www.uoguelph.ca/foodscience/dairyscience-and-technology/dairy chemistryand- physics. Acesso em: 10 de novembro de 2022, p. 597-608, 1998

GOFF, H. D. University of Guelph. Dairy Science and Technology, 2009.

MARKUS, C. R.; OLIVER, B.; DE HAAN, E. H. F. Whey Protein rich in alfalactoalbumin increases the ratio of plasma tryptophan to the sum of the other large neutral amino acids and improves cognitive performance in stress-vulnerable subjects. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 75, 2002,  p. 1051-6

NASCIMENTO, Ronny Rodrigues do. Caracterização composicional e determinação rápida de proteínas em leite concentrado por ultrafiltração. 2023. 69 f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2023

OLIVEIRA, Karla Michelli Garcia de; SEGHETO Luciana; FURTADO, Marco Antônio Moreira. Estudo Comparativo entre Métodos do Formol e de Kjeldahl para Determinação de Proteínas em Leite. Anais do XXIII Congresso Nacional de Laticínios. 06 n° 351. vol. 351 Juiz de Fora. Jul/Ag. 2006, p 196

PYNE, G. T. E McGann, T. C. The colloidal phosphate of Milk. II. Influence of citrate. J. Dairy Res., 1960, p. 27:9-17

RICHMOND, D. H. E Miller, E. H. Note on a recent paper by R. Steinneger on the “Aldehyde Figue” of milk. The Analyst, 1906, cap.  31:224-26.

SILVA, P.H.F. ; FERREIRA, R.J. ; CARMÉLIO, C.E. ; VALE, R. X.F.Testes estatísticos para comparação entre métodos de análises. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, 1993,  p. 289.

SINGH H. Heat stability of milk. International Journal of Dairy Technolog, v. 57, 2004.

STEINEGGER, R. Z. Unters. Nahr. Genussm. 10:659, The “Aldehyde Value” of milk. The Analyst, 31:45, 1905

WOLFSCHOON, F. A. ; VARGAS, L.O.Aplicação do método de formol para determinação do conteúdo de proteína no leite cru e pasteurizado. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, 1977, p. 192.

ZAVAREZE, E. R.; MORAES, K. S.; SALASMELLADO, M. M. Qualidade tecnológica e sensorial de bolos elaborados com soro de leite. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 30, n.1, 2010, p. 102-106.