Citometria de fluxo para avaliar paraprobióticos em produtos lácteos

_{Cássia P. Barros¹,  Júlio Cesar Q. Penha¹,Ramon S. Rocha^1,2 , Luiz Dione B. Melo³, Jonas T. Guimarães¹, Erick A. Esmerino¹, Mônica Q.Freitas¹, Márcia Cristina Silva³, Adriano G. Cruz³}

_{¹Universidade Federal Fluminense (UFF), Faculdade de Medicina Veterinária
²Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ),  Departamento de Biotecnologia
³Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ),  Departamento de  Alimentos}

Diversos fatores têm influenciado na qualidade da vida moderna, de modo que a população está se tornando cada vez mais consciente sobre a importância dos alimentos funcionais, ou seja, que possuem em sua composição substâncias biologicamente ativas que auxiliam na redução do risco de desenvolvimento de doenças e manutenção da saúde.  

Diante do exposto, nos últimos anos houve um crescente interesse do mercado em promover a saúde de maneira natural, o que desencadeou a produção em larga escala de novos produtos com apelo funcional, que incluem desde suplementos farmacêuticos contendo microrganismos probióticos, bem como a sua adição em vários alimentos, principalmente em produtos lácteos que já possuem uma reputação positiva na mente do consumidor independente do seu nível sócio econômico.

Os benefícios clínicos proporcionados pelos microrganismos probióticos, como o auxílio na regulação da microbiota e função intestinal, modulação do sistema imune, inibição de patógenos, entre outros, estão bem documentados na literatura. Tais benefícios são fornecidos devido às interações entre os probióticos, a microbiota gastrointestinal e o sistema imunológico.

A definição de probióticos atualmente em vigência promulga que a viabilidade representa um requisito essencial para assegurar os efeitos benéficos na saúde do consumidor. Por outro lado, nos últimos anos, estudos apontaram que as células microbianas não viáveis (mortas), portanto, não cultiváveis e, possivelmente, imunologicamente ativas, também podem fornecer benefícios à saúde, ou seja, nem todos os benefícios clínicos estão diretamente relacionados à bactéria viável.

Os paraprobióticos, também conhecidos como probióticos inativados, probióticos não viáveis ou probióticos fantasmas são definidos como células microbianas não viáveis (intactas ou quebradas) ou frações celulares que, quando ingeridas em quantidades e frequência adequadas, conferem benefícios aos consumidores. São microrganismos que perderam sua viabilidade após serem submetidos a processos que modificaram as estruturas celulares (quebra de filamentos de DNA, ruptura de membrana celular ou dano mecânico ao envelope celular) ou até mesmo as funções metabólicas microbianas (inativação de enzimas chave ou a perda da seletividade da membrana).

Pesquisas recentes evidenciaram os efeitos biológicos fornecidos pelos paraprobióticos através de ensaios in vivo e in vitro, como: modulação do sistema imune e da microbiota intestinal; tratamento de doenças hepáticas induzidas pelo álcool; de infecções virais, melhora na regulação da função intestinal, na dermatite atópica, colite e doenças respiratórias; inibição de patógenos e de certos tipos de câncer; prevenção de cáries dentárias; manutenção da integridade intestinal; redução do colesterol; profilaxia e tratamento de doenças infecciosas e de alergias respiratórias e alimentares, melhora nos sintomas associados ao estresse, humor e qualidade do sono.

Os paraprobióticos podem trazer algumas vantagens tecnológicas importantes para os fabricantes de alimentos quando comparados aos microrganismos vivos já que não há mais a necessidade de garantir a viabilidade durante o processamento e armazenamento do alimento até a ingestão pelo consumidor visto que o probiótico está morto - o que permite a sua adição em uma grande variedade de alimentos que poderiam ser considerados substratos estressantes aos probióticos vivos (sem afetar o prazo comercial do produto).

Além disso, diferente dos probióticos que possuem baixa resistência térmica, as propriedades funcionais dos paraprobióticos permanecem estáveis durante uma ampla faixa de temperatura, o que facilita não só o armazenamento e transporte, mas principalmente a manipulação e o processamento dos produtos lácteos, pois podem ser acrescentados antes da pasteurização do leite, reduzindo a possibilidade de contaminação microbiológica após o processamento. Adicionalmente, representam uma opção mais segura quando a administração de bactérias vivas não for indicada, eliminando os riscos de patogenicidade oportunista e desenvolvimento de resistência a antibióticos.

Os paraprobióticos podem ser produzidos através da inativação dos probióticos por diversos processos, como: aplicação de calor, liofilização, ácido e formalina ou ainda por tecnologias emergentes (como a alta pressão hidrostática), ultrassom de alta intensidade, irradiação gama e raios UV.  Os métodos de inativação utilizados na produção dos paraprobióticos possuem diferentes mecanismos de ação e, consequentemente, podem atingir de maneiras distintas as estruturas e propriedade funcionais das células bacterianas. Portanto, além de inativar, o tratamento escolhido deve ser capaz de manter o efeito benéfico inicialmente produzido pelas bactérias vivas.

A técnica tradicional de plaqueamento ou contagem em placas tem sido utilizada como método padrão para avaliar a inativação do probiótico para a produção do paraprobiótico. Portanto, ela somente quantifica o número de células capazes de se multiplicar e formar colônias visíveis em meios de cultura adequados, não fornecendo informações sobre a integridade e as funções fisiológicas das células bacterianas não cultiváveis.

A citometria de fluxo é considerada um método relativamente novo que permite uma descrição detalhada da viabilidade bacteriana com informações em relação à estrutura e propriedades funcionais celulares. Tais informações são extremamente relevantes porque podem auxiliar na escolha dos melhores métodos e condições de inativação considerando o grau de lesão causado por cada processo nas cepas paraprobióticas estudadas, assim como os mecanismos de ação envolvidos.

Evidências científicas apontam a citometria de fluxo como uma técnica promissora por ser rápida e direta, sendo capaz de fornecer resultados precisos da análise de múltiplos parâmetros celulares simultaneamente e em tempo real, além de possibilitar a avaliação de mais de dez mil células por amostra e ocupar menor espaço, tempo e trabalho se comparada à técnica convencional de contagem em placas.  

A análise da viabilidade bacteriana por citometria de fluxo consiste, basicamente, no uso de um instrumento automatizado que combinado com corantes fluorescentes, identificam, enumeram e caracterizam as propriedades funcionais das células.  Os corantes fluorescentes são capazes de se ligar a partes específicas das células bacterianas emitindo luz fluorescente, que é detectado pelo equipamento, sendo possível obter informações sobre parâmetros biológicos celulares, como a presença de atividade enzimática intracelular e citoplasmática, funcionalidade do potencial de membrana, integridade da membrana e atividade respiratória. A seguir estão relacionados os principais corantes utilizados na citometria de fluxo e suas respectivas funções:

• Diacetato de fluoresceína (FDA): avalia a atividade enzimática e integridade da membrana celular;
• Iodeto de Propídio (PI): usado para verificar a integridade da membrana citoplasmática;
• Ácido (bis-1,3-dibutilbarbitúrico) trimetina oxonol (DiBAC₄(3):  também conhecido como BOX é utilizado para medir o potencial de membrana;
• Laranja tiazole (TO): determina a contagem total de células bacterianas vivas ou inativadas;
• Cloreto de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazólio (CTC):  sal, frequentemente usado como indicador de respiração bacteriana.

Importa ressaltar que o preparo da amostra é de crucial importância para o sucesso da citometria de fluxo. Produtos lácteos contêm proteínas, gorduras e geralmente devem passar por etapas de centrifugação e filtração por membrana (muitas vezes mais de uma vez) para a qualidade do extrato produzido e para obtenção de resultados confiáveis bem como evitar danos ao equipamento, no caso o citômetro de fluxo. Adicionalmente, como o citômetro de fluxo possui características intrínsecas, os testes prévios de validação devem ser realizados levando em conta suas considerações intrínsecas.

Nesse contexto, a citometria de fluxo surge como uma técnica promissora, pois fornece informações rápidas e confiáveis sobre as alterações no metabolismo e na morfologia da célula bacteriana induzidas pelos métodos de inativação, o que além de contribuir para escolha dos melhores tratamentos e condições para cada cepa, pode auxiliar na elucidação dos mecanismos de ação envolvidos em cada tratamento. Inclusive, ser usada como uma ferramenta de controle de qualidade e otimização durante o desenvolvimento e armazenamento de produtos lácteos paraprobióticos.

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