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Análise de micotoxinas em silagens

POR RAFAEL CAMARGO DO AMARAL

E THIAGO BERNARDES

THIAGO FERNANDES BERNARDES

EM 23/12/2009

5 MIN DE LEITURA

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Testes para micotoxinas podem ser realizados por uma variedade de métodos qualitativos ou quantitativos. Entretanto, a análise de micotoxinas em silagens pode ser um desafio mesmo para os laboratórios mais experientes, devido à natureza complexa da matriz de silagem, que contém muitas interferências potenciais que podem ser extraídas com as micotoxinas. A maioria dos métodos analíticos e kits de teste não podem ser aplicados à silagem.

Teste qualitativo

Vários kits de testes qualitativos (ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assays) estão comercialmente disponíveis para análise das micotoxinas mais comuns em silagens. Esses kits mostram apenas se o resultado é positivo ou negativo, e são utilizados para aceitar ou rejeitar alimentos ou grãos antes da compra para alimentação animal. Assim, esses kits fornecem uma análise rápida (5 a 10 minutos) e são interpretados por comparação visual de cores. O teste positivo é indicado por ausência completa de cor ou cor mais fraca quando comparado com o controle. O teste negativo é indicado pela presença de cor (normalmente azul) ou com cor mais forte quando comparada ao controle.

As vantagens dos kits de teste qualitativo ELISA são:
- Rapidez (5 a 10 minutos);
- Utilização no próprio local, com pouco treinamento;
- Não são necessários equipamentos caros;
- Pode ser realizado um teste de cada vez;
- Os kits são relativamente baratos (US$ 6 a 10 por teste).

Já as desvantagens são:
- Os kits de testes normalmente expiram em seis meses;
- Devem ser armazenados sob refrigeração;
- Não fornecem a concentração exata de micotoxina;
- Cada teste deve ser utilizado separadamente para cada micotoxina;
- Os testes podem fornecer resultados falso positivos.

Um resultado falso positivo é obtido quando a silagem é reportada como positiva pelo kit de teste, quando o alimento realmente contém menos ou nenhuma micotoxina do que apresente. Isso é devido a uma interferência na matriz da silagem, que pode afetar a formação de cor durante a análise ELISA. O kit de teste deve ser validado pela análise de amostras de silagem conhecidamente positivas e negativas. Se houverem interferências nos estratos de silagem que afetem os resultados, o extrato deve ser parcialmente purificado antes do teste. Há colunas de fase sólida comercialmente disponíveis que purificam rapidamente os estratos amostrados para remover interferências potenciais antes de aplicação do teste ELISA.

Testes quantitativos

Existem dois tipos diferentes de testes quantitativos de micotoxinas: kits de teste baseados em anticorpos (ELISA) e métodos cromatográficos. A escolha do método depende da acurácia desejada, do tempo de análise, do equipamento disponível, do custo de novos equipamentos e do nível de técnicos especializados.

Os testes baseados em anticorpos estão disponíveis pra quase todas as micotoxinas prevalecentes. Esses kits podem ser baseados no desenvolvimento visual de cores (métodos ELISA) ou desenvolvimento de fluorescência (colunas de afinidade). Os métodos ELISA usam anticorpos que são muito específicos para uma particular micotoxina. Uma série de padrões de concentração conhecida é analisada juntamente com as amostras desconhecidas. A cor formada é inversamente proporcional à concentração de micotoxinas.

A absorbância de cor para cada padrão é desconhecida, e determinada por um prato leitor ELISA. As absorbâncias das amostras padrão são então utilizadas para criar uma curva de calibração, onde as concentrações das amostras são calculadas. Já as colunas de afinidade usam uma técnica completamente diferente da dos kits ELISA. As amostras de estratos são carregadas numa coluna de afinidade, as interferências são lavadas com água e a micotoxina sai da coluna. A solução contendo micotoxina purificada reage desenvolvendo fluorescência e é analisada utilizando um fluorômetro.

As vantagens do teste quantitativo ELISA e da coluna de afinidade são:
- Eles são de simples utilização;
- O tempo de análise é relativamente curto (20 a 30 minutos);
- Podem ser realizadas no local com um mínimo de treinamento.

Já as desvantagens dos kits de testes quantitativos são:
- Os equipamentos necessários custam entre US$ 2000 e 4000;
- O kit de teste ELISA não pode ser efetivamente analisado com uma amostra de cada vez, pois a curva completa deve ser re-testada em cada rodada;
- Os kits de teste ELISA devem ser mantidos sob refrigeração;
- Os kits possuem vida útil de seis meses a um ano;
- Uma análise separada deve ser realizada para cada micotoxina;
- Os kits são sujeitos a fornecer resultado falso positivos;
- Não há maneira de detectar problemas durante o teste.

Assim como os kits de testes qualitativos, os kits de testes quantitativos também podem apresentar resultado falso positivos para análise de silagens. Cada método deve ser validado utilizando-se amostras conhecidamente positivas e negativas. Se as interferências nos extratos de silagem causar resultados falsos positivos, o extrato da amostra deve ser parcialmente purificado utilizando-se uma coluna de fase sólida antes da análise com os kits de teste. Todas as amostras com resultado positivo e elevado nível de significância devem ser enviadas para um laboratório de referência que não use kits de teste, para confirmação dos resultados.

Os métodos cromatográficos são rotineiramente utilizados para análise de micotoxinas. Essas técnicas incluem Cromatografia da Camada Fina (TLC), Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) e Cromatografia Gasosa (GC). Esses métodos normalmente requerem uma extração da amostra utilizando solventes orgânicos, purificação do extrato, evaporação do solvente para concentrar as micotoxinas e re-dissolução em solvente próprio para cromatografia. Esse método isola cada componente no extrato purificado da amostra. As micotoxinas isoladas são então identificadas e quantificadas utilizando-se concentrações conhecidas de padrões de micotoxinas puras. Os métodos cromatográficos são geralmente considerados métodos de referência para comparação com kits de testes.

As vantagens dos métodos cromatográficos são:
- São considerados métodos de referência para análise de micotoxinas;
- Há considerável flexibilidade no número de amostras que podem ser analisadas de uma vez;
- Têm capacidade de realizar análises de multitoxinas;
- Geralmente as interferências podem ser observadas no TLC ou nos cromatogramas GC e HPLC, separando a interferência das micotoxinas;
- O método TLC necessita de pouco equipamento.

Já as desvantagens desse método são:
- Equipamentos de HPLC e GC são caros (US$ 20.000 a 30.000);
- Técnicos experientes devem manter e operar os equipamentos HPLC e GC, assim como interpretar os cromatogramas;
- Os métodos TLC requerem o uso de solventes orgânicos, que necessitam de uma capela exaustora;
- É necessária experiência para interpretar e quantificar as micotoxinas pelo método TLC.

Análises de micotoxinas em grãos de cereais já são rotinas em armazéns e laboratórios. Atualmente, tem-se notado interesse por avaliações em silagens, visto que este tipo de alimento também apresenta propensão ao desenvolvimento de fungos e, consequentemente, a presença de micotoxinas. A busca por este tipo de análise é crescente, um forte indicativo de aperfeiçoamento em nosso setor produtivo.

RAFAEL CAMARGO DO AMARAL

Zootecnista pela Unesp/Jaboticabal.
Mestre e Doutor em Ciência Animal e Pastagens pela ESALQ/USP.
Gerente de Nutrição na DeLaval.
www.facebook.com.br/doctorsilage

THIAGO BERNARDES

Professor do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Lavras (UFLA) - MG.
www.tfbernardes.com

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