Autores do artigo:

Thomer Durman e Geraldo Tadeu dos Santos, do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia (PPZ) da Universidade Estadual de Maringá (UEM)

Sharon Huws, da Queen’s University Belfast (Reino Unido)

Desde o desenvolvimento e conclusão do projeto genoma humano em 2003, e a introdução do sequenciamento de nova geração, em 2007, as tecnologias em sequenciamento genético têm evoluído muito e assim, análises genômicas tem se tornando cada vez mais acessíveis e menos dispendiosas. Nos últimos anos, rapidamente, diversos avanços em descobertas na área têm decolado, aplicando-se em diversas espécies e níveis celulares.

O rúmen, um dos ambientes orgânicos mais complexos da natureza não ficou de fora, e tem sido protagonista na descoberta de novos genes e enzimas envolvidas em diversos processos, devido principalmente, à grande complexidade da comunidade microbiana no ambiente ruminal na degradação de biomassa.

O rúmen tem sua comunidade microbiana explorada in vitro desde os anos 50, com o desenvolvimento de técnicas de cultivo in vitro anaeróbico. Assim, diversas espécies que habitam o ambiente ruminal foram isoladas e atualmente é possível fazer o estudo aprofundado da biologia destas, como por exemplo, frente à degradação de diversos compostos, resistência a substâncias nocivas, adaptação a diversidades do ambiente, dentre outras características. Entretanto, o gargalo encontrado no desenvolvimento das pesquisas é a grande quantidade de espécies ruminais que ainda não foram isoladas, as denominadas espécies incultiváveis em meio de cultura. Mesmo que diversos pesquisadores já tenham conseguido cultivar e isolar espécies que no passado já foram consideradas incultiváveis, ainda é pequena (<10% da comunidade microbiana ruminal) a porção possivelmente cultivável em ambiente de laboratório.

Frente à dificuldade de mimetizar as condições encontradas no rúmen e a ampla quantidade de informação biológica a ser explorada, se fez necessário utilizar metodologias e tecnologias que permitam análises gênicas dos microrganismos do rúmen sem a necessidade de isolamento e cultivo em laboratório. Assim, a metagenômica e metatranscriptômica se tornam peça chave, para que estudos da microbiota ruminal sigam avançando, em busca de novos genes e funções metabólicas.

A metagenômica e metatranscriptômica ruminal representam, respectivamente, o isolamento e estudo do DNA e RNA da comunidade microbiana que habita o rúmen. As aplicações das técnicas são amplas e podem revelar a presença de genes (isolamento do DNA) importantes em determinada característica, como na degradação de um determinado composto, bem como demonstrar quais genes são expressos (isolamento do RNA) frente a uma variável experimental, como a presença de substâncias nocivas (antibióticos) aos microrganismos. As técnicas laboratoriais são seguidas de sequenciamento de nova geração e análises bioinformáticas.

Em projeto de pesquisa realizado na Aberystwyth University (Reino Unido) em parceria com a Universidade Estadual de Maringá foram aplicadas técnicas de metagenômica e metatranscriptômica para avaliar os microrganismos ruminais. As mesmas serão exemplificadas brevemente para demonstrar algumas das atuais possibilidades de análise da comunidade microbiana do rúmen.

A complexidade envolvida em isolar e cultivar microrganismos do rúmen, em adição com a facilidade de crescimento e cultivo de bactérias como Escherichia coli em meios de cultura simples, resulta em técnicas como a de preparação de bibliotecas metagenômicas, a qual consiste de inserir e incorporar material genético (DNA plasmidial) proveniente de microrganismos ruminais no material genético de Escherichia coli. Desta forma, a E. coli, neste caso, se comporta como a bactéria que a doou material genético (em relação à inserção de DNA doada). Como exemplo, uma Escherichia coli incapaz de degradar determinado composto, após a inserção, passa a degradar o composto, pois passa a possuir a informação genética que codifica a enzima envolvida na degradação do composto. Em adição à inserção de DNA plasmidal ruminal (via vetor de clonagem e bacteriófagos) se insere a resistência a uma substância nociva, como cloranfenicol. Assim, quando se faz o cultivo pós-inserção das colônias em meio contendo cloranfenicol, por exemplo, as bactérias as quais houve falha de inserção dos genes não sobrevivem ao meio, e apenas as que foram modificadas com sucesso são selecionadas para serem inseridas na biblioteca.

A biblioteca consiste na organização das colônias de forma individualizada em placas contendo diversos poços. Cada colônia é alocada individualmente para serem testadas posteriormente. Neste estudo foi construída uma biblioteca 16S rDNA com 30 placas de 384 poços, totalizando mais de 11.500 colônias alocadas (Figura 1).

A inserção dos genes provenientes do rúmen é distribuída randomicamente e em larga escala. Neste estudo, por exemplo, foram pesquisadas um total de 11.520 colônias de Escherichia coli modificadas (com inserção de DNA proveniente de microrganismo do rúmen). Para identificação de colônias positivas podem ser realizadas diversas metodologias, como exemplo, pode-se adicionar um antibiótico ao meio de cultura e testar todas as colônias modificadas, aquelas que sobreviverem, possuem algum gene que favoreceu o seu desenvolvimento mesmo no ambiente hostil. Essas colônias são consideradas positivas para o teste de varredura e seguem para sequenciamento e análise dos genes presentes - para ter ciência de qual gene favoreceu a bactéria no teste.

Figura 1. Colônias de Escherichia coli modificadas sendo alocadas em placa na biblioteca metagenômica. O meio de cultura possui cloranfenicol, o que não permite a sobrevivência de bactérias que não passaram pelo processo de inserção de genes (o qual inclui gene de resistência a cloranfenicol).



A biblioteca metagenômica foi submetida a testes de varredura para degradação de lignanas (antioxidante) da linhaça. É importante se ter conhecimento dos processos metabólicos deste composto, pois devido à fermentação ruminal, produtos da quebra (enterolignanas) destes antioxidantes passam para o produto animal (carne e leite) e tem ação benéfica à saúde de quem os consome.

Neste estudo, das 11.520 colônias da biblioteca, 144 apresentaram uma atividade de degradação de lignanas acima das demais. Essas foram sequenciadas (metodologia Hiseq - Illumina®), passaram por análise bioinformática via computador de alto desempenho (HPC - 4.2TB RAM e 43TB capacidade de armazenamento) e os genes que diferem do genoma referência irão ser avaliados individualmente para identificação dos genes possivelmente responsáveis pela mudança de característica observada nos testes.

Outra abordagem empregada neste estudo foi a metatranscriptômica, a qual consiste em expor uma comunidade microbiana a determinado meio experimental, isolar o RNA e avaliar a expressão de genes após incubação. Assim foram realizadas incubações in vitro de conteúdo ruminal adicionando ou não lignanas da linhaça aos meios de cultura (Figura 2). Desta forma, ao se comparar os genes expressos no meio com o composto com os expressos no meio sem o composto se pode determinar quais são expressos apenas na presença do mesmo. Neste caso, todas as amostras são submetidas ao sequenciamento (Hiseq - Illumina®), análise bioinformática e estudo dos genes.

Figura 2. Organização de incubações em tubos tipo Hungate de líquido ruminal (proveniente de três animais) com meio de cultura anaeróbico, em triplicatas (cada tubo com material de um animal diferente), com ou sem composto teste. As expressões de genes entre as amostras são comparadas após a incubação.

Com toda a complexidade microbiana e o potencial de degradação de biomassa no rúmen, as possibilidades de descobertas de novas enzimas e importantes genes envolvidos nos processos metabólicos, bem como da biologia dos microrganismos, são promissoras. Procurar cultivar o considerado incultivável sem dúvidas pode ser visto como um desafio e oportunidade de avanço científico.

Entretanto, metodologias que não contam necessariamente com isolamento e cultivo de microrganismos são essenciais para que a exploração de descobertas englobe não só organismos cultiváveis como os até o momento – mas também, os considerados incultiváveis, os quais tem maior representatividade no rúmen.