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Peroxidase e fosfatase: em que consiste estas análises?

POR MICHELE FANGMEIER

INDÚSTRIA DE LATICÍNIOS

EM 17/04/2017

3 MIN DE LEITURA

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Atualizado em 02/02/2021

As análises de peroxidade e fosfatase são realizadas nas indústrias de laticínios e fornece informações sobre o tratamento térmico de pasteurização. 

Peroxidase

Tem por objetivo controlar a pasteurização do leite, pois a peroxidase é uma enzima oxidante, que é destruída a 80ºC por alguns segundos. A presença desta enzima índica que o leite não foi superaquecido durante a pasteurização, a ponto de provocar perdas de constituintes, bem como sua inativação.

Portanto, espera-se encontrar resultados de peroxidase positiva para leites cru e pasteurizado, já para o leite UHT a peroxidase deve ser negativa. Existe a metodologia de análise tradicional, bem como uma metodologia alternativa.

  • Metodologia tradicional: a enzima peroxidase ao hidrolisar o peróxido de hidrogênio, libera oxigênio, fazendo com que o guaiacol obtenha uma coloração laranjada, que significa resultado positivo.
  • Metodologia alternativa: a peroxidase catalisa a degradação da água oxigenada, liberando O2, que reage com o 2-metroxyphenol dando a origem a um cromóforo que permite ser visualizado pela mudança de coloração, o que comprova a atividade enzimática.


Metodologia tradicional

Para realizar a análise serão necessários os seguintes materiais e reagentes: tubo de ensaio, pipeta com capacidade 10/ 0,5/ 2 mL, espátula, pera de sucção ou pipetador e dispensador automáticos, banho-maria a 45°C, peróxido de hidrogênio 10 vol ou 3%, guaiacol 1%.

Procedimento de análise:

  • Homogeneizar a amostra com espátula
  • Pipetar 10 mL de amostra para um tubo de ensaio
  • Colocar em banho-maria a 45º C por 5 minutos
  • Adicionar 2 mL de Guaiacol ao tubo de ensaio
  • Acrescentar 3 gotas de Peróxido de Hidrogênio 10 vol. ou 3% (água oxigenada)
  • Observar a coloração: se o teste for positivo, torna-se visível um anel cor salmão pouco abaixo da superfície do leite. Em caso de teste negativo o leite permanecerá branco
  • Se o leite estiver cru, também formará o anel cor salmão.

Metodologia alternativa

  • Homogeneizar a amostra com espátula
  • Imergir a tira reagente na amostra, por 10 segundos para permitir sua absorção
  • Atentar para que a tira não entre em contato com nada, evitando contaminação cruzada
  • Proceder à leitura
  • Aparecimento de uma coloração tijolo (marrom avermelhada) na tira indica teste peroxidase positivo, sem alteração na coloração da tira considerar resultado negativo para peroxidase.

 

peroxidase - leite

Fosfatase

Tem por objetivo controlar a eficiência da pasteurização do leite, uma vez que sua presença constitui indicativo de que o leite não sofreu tratamento térmico adequado, no qual o processo se baseia na liberação do fenol de compostos fosforados.

Trata-se de uma enzima hidrolítica de presença normal no leite cru e destruída pelo calor produzido no processo de pasteurização (72ºC/ 15 segundos). Cabe ressaltar que a resistência ao calor da enzima fosfatase é ligeiramente superior à das bactérias patogênicas que possam existir no leite.

O p-nitrofenilfosfato é hidrolisado a fim de formar p-nitrofenol e fosfato, na presença do tampão AMP (aminimetil-propanol). O nitrofenol formado possui coloração amarela. Portanto, espera-se encontrar resultado positivo para fosfatase apenas para o leite cru, devendo o resultado necessariamente ser negativo para os leites pasteurizado e UHT.

Metodologia tradicional

Para realizar a análise serão necessários os seguintes materiais e reagentes: tubo de ensaio, pipetas graduadas de 1 mL, pera de sucção, espátula, banho-maria a 37º C, reagente para fosfatase.

Procedimento de análise:

  • Retirar da geladeira o reagente para fosfatase (já preparado);
  • Homogeneizar o frasco, com inversões;
  • Homogeneizar a amostra com espátula;
  • Colocar 3 gotas (0,1 mL) de leite em um tubo de ensaio com o auxílio de uma pipeta graduada e pera de sucção;
  • Pipetar com uma pipeta graduada e pera de sucção 1 mL de reagente para teste fosfatase;
  • Incubar por 3 minutos em banho-maria à 37º C;
  • Observar a coloração: amarelo fosforescente indica resultado positivo para fosfatase, e incolor indica resultado negativo para fosfatase.


Metodologia alternativa

  • Deixar as tiras e a amostra adquirirem temperatura ambiente;
  • Homogeneizar a amostra com espátula;
  • Imergir a tira reagente na amostra de leite durante 10 segundos;
  • Atentar para que a tira não entre em contato com nada, evitando contaminação cruzada;
  • Aguardar de 2 a 3 minutos;
  • Realizar a leitura da tira;
  • Aparecimento da cor amarela indica fosfatase positiva. Incolor/Amarela Pálida, indica fosfatase negativa.

Abaixo imagem do teste de fosfatase:

fosfatase - leite

 

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Referências 

BEHMER, A. M. L. Tecnologia de leite, Livraria Nobel S/A, São Paulo-SP, 1982, 12° edição, 320p, p.108-109. A reference method for measurement of alkaline phosphatase activity in human serum. Study group on alkaline phosphatase. Clin. Chem, 29: 751, 1983.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Instrução Normativa 68 de 12/12/2006. Métodos analíticos oficiais Físico-Químico para controle de leite e produtos Lácteos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil – Cap. Métodos qualitativos.

MICHELE FANGMEIER

Técnica em Gestão Ambiental pelo Colégio Teutônia. Graduada em Química Industrial pela Univates. Mestranda CAPES em Biotecnologia na Produção Industrial de Alimentos. Atua como Supervisora de Laboratório de Controle de Qualidade de Laticínios.

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MAURICIO ZAMPRONIO AFFONSO

SANTA RITA DO PASSA QUATRO - SÃO PAULO - INDÚSTRIA DE LATICÍNIOS

EM 23/09/2020

Os artigos em geral sempre são bem escritos e exclarecedores.
CESAR FRANCHI

LONDRINA - PARANÁ - ESTUDANTE

EM 21/10/2019

Obrigado Michele pela sua explanação clara e objetiva. Em poucas palavras disse tudo.
MARCIO ROBERTO CARIELO DA SILVA

RECIFE - PERNAMBUCO - ESTUDANTE

EM 06/09/2019

muito fácil compreensào
ajuda muito o aluno em geral
JOZYELDA FREITAS DA ROCHA

EM 07/05/2018

Obrigada, muito bom
ANTONIO MÁRIO DE SOUSA GONÇALVES

EM 17/04/2018

Gostei bastante dessas informações, serão úteis no meu trabalho atual que é supervisor de qualidade em uma empresa do seguimento de laticínios.
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