Entre as causas da instabilidade do leite ao etanol, podemos apontar: o desenvolvimento de bactérias fermentadoras da lactose e a conseqüente elevação da acidez, elevada incidência de mastite no rebanho e desequilíbrio salino no leite.

Tem sido observada em várias regiões a ocorrência de positividade do leite de alguns produtores, mesmo considerando que estas são amostras de leites não ácidos. Uma possível causa da alteração na estabilidade do leite ao etanol pode ser a multiplicação de bactérias psicrotróficas durante o período de armazenamento refrigerado, o que leva à produção de enzimas termoestáveis, como as proteases. Para estudar este assunto, foi desenvolvido um estudo na Embrapa Gado de Leite, avaliando-se a ação de microrganismos Pseudomonas spp. proteolíticos. Além de proteolíticas, as espécies do gênero Pseudomonas são as bactérias psicrotróficas de menor tempo de geração, e passam a predominar no leite cru refrigerado, muito embora correspondam, na maioria dos casos, em menos de 10% da microbiota contaminante do leite fresco.

Para o desenvolvimento do experimento, foi utilizado leite cru, ao qual foram adicionados dois diferentes isolamentos de Pseudomonas spp obtidas a partir do leite cru refrigerado, de forma a obter contagens no leite na ordem de 10⁴, 10⁵ e 10⁶ ufc/mL. O leite foi então incubado a 7,0 ± 1^oC, a partir do que foram coletadas amostras nos tempos 0, 24, 48, 72 e 96 horas e analisadas quanto à contagem de bactérias psicrotróficas, acidez titulável (graus Dornic), pH, dosagem de ácido siálico livre e estabilidade ao etanol a 62^o GL com incrementos de 2^o GL até 88^o GL.

Foi observado que o número de Pseudomonas spp. aumentou atingindo a ordem de 10⁷ em 48 horas e 10⁸ ufc/mL em 96 horas de incubação a 7^oC. A acidez e o pH permaneceram estáveis para todas as amostras durante o período de estocagem, com valores de 15,5 ± 1^oD e 6,75 ± 0,07, respectivamente.

O leite controle que não sofreu inoculação de Pseudomonas spp. foi estável ao etanol até a mais alta concentração testada, de 88 ^oGL, durante todo o período. A estabilidade do leite sofreu influência da bactéria testada, com a concentração inicial de bactérias ou com o tamanho do inóculo. O leite com menor inóculo inicial (10⁴ ufc/mL) e o com maior inóculo (10⁶ ufc/mL) apresentaram com 24 h de incubação, coagulação a 88 e 80^oGL, respectivamente, porém com 72 h, ambos apresentaram contagens em níveis de 10⁷ ufc/mL e coagularam a 80 e 70^o GL, respectivamente.

Tabela 1. Número de Pseudomonas (ufc/mL) em leite incubado a 7^oC.


As amostras de leite inoculado com Pseudomonas spp. foram submetidas à detecção de ácido siálico livre para confirmação da atividade da protease(s) bacteriana. O ácido siálico aparece no leite associado à micela de caseína (parte C-terminal da k-caseína), mas a ocorrência de proteólise permite sua detecção na forma livre desde que o ponto de clivagem fosse anterior à sua posição na cadeia. As amostras de leite no tempo zero apresentaram resultados negativos quanto à presença de ácido siálico, mas os resultados foram positivos para todas as amostras inoculadas pelo menos em um dos tempos estudados. De acordo com os autores do estudo, os resultados sugerem ação da(s) protease(s) bacteriana(s) na k-caseína, demonstrando correlação entre a perda de estabilidade ao etanol e proteólise.

Tabela 2. Resultados da detecção de ácido siálico livre em leite inoculado com Pseudomonas spp. e incubado a 7^oC.


Desta forma, segundo os autores, a multiplicação de Pseudomonas spp. no leite a 7^oC influenciou a estabilidade do leite ao etanol, além de resultar em positividade no teste de dosagem de ácido siálico, indicando hidrólise da k-caseína. Pode-se destacar que estes efeitos variaram em intensidade em função da Pseudomonas sp. testada. Os resultados apontam que a ocorrência de bactérias psicrotróficas proteolíticas no leite cru pode implicar em resultados positivos nos testes do álcool nas concentrações normalmente usadas na indústria apenas se estas atingirem altas concentrações no leite cru, em níveis de 10⁷ ufc/mL. Porém, na dosagem do ácido siálico para pesquisa por fraude de leite com soro, resultados positivos poderiam ocorrer para contagens iguais ou maiores que 3,2 x 10⁵ ufc/mL .

Fonte: Arcuri et al, 2004. I Congresso Brasileiro de Qualidade do Leite - I CBQL, 2004, Passo Fundo-RS. O Compromisso com a qualidade do leite no Brasil. Passo Fundo-RS: UPF Editora, 2004.