Análises de peroxidase e fosfatase

Análises de peroxidase e fosfatase no leite

As análises de peroxidase e fosfatase fornece informações sobre o tratamento térmico de pasteurização do leite.

O que indica o teste de peroxidase no leite?

Tem por objetivo controlar a pasteurização do leite, pois a peroxidase é uma enzima oxidante, destruída a 80°C por alguns segundos. A presença desta enzima índica que o leite não foi superaquecido durante a pasteurização, a ponto de provocar perdas de constituintes, bem como sua inativação.

Resultados do teste de peroxidase no leite

Espera-se encontrar resultados de peroxidase positiva para leites cru e pasteurizado, já para o leite UHT a peroxidase deve ser negativa.

Como realizar o teste de peroxidase no leite?

Existe a metodologia de análise tradicional, bem como uma metodologia alternativa.

• Metodologia tradicional;
• Metodologia alternativa.

Metodologia tradicional teste de peroxidade no leite

A enzima peroxidase, ao hidrolisar o peróxido de hidrogênio, libera oxigênio, fazendo com que o guaiacol obtenha uma coloração laranjada, que significa resultado positivo.

Para realizar a análise serão necessários os seguintes materiais e reagentes: tubo de ensaio, pipeta com capacidade 10/ 0,5/ 2 mL, espátula, pera de sucção ou pipetador e dispensador automáticos, banho-maria a 45°C, peróxido de hidrogênio 10 vol ou 3%, guaiacol 1%.

Procedimento de análise:

• Homogeneizar a amostra com espátula;
• Pipetar 10 mL de amostra para um tubo de ensaio;
• Colocar em banho-maria a 45º C por 5 minutos;
• Adicionar 2 mL de Guaiacol ao tubo de ensaio;
• Acrescentar 3 gotas de Peróxido de Hidrogênio 10 vol. ou 3% (água-oxigenada);
• Observar a coloração: se o teste for positivo, torna-se visível um anel cor salmão pouco abaixo; da superfície do leite. Em caso de teste negativo o leite permanecerá branco;
• Se o leite estiver cru, também formará o anel cor salmão.

Metodologia alternativa teste de peroxidase no leite 

A peroxidase catalisa a degradação da água-oxigenada, liberando O₂, que reage com o 2-metroxyphenol dando a origem a um cromóforo que permite ser visualizado pela mudança de coloração, comprovando a atividade enzimática.

• Homogeneizar a amostra com espátula;
• Imergir a tira reagente na amostra, por 10 segundos para permitir sua absorção;
• Atentar para que a tira não entre em contato com nada, evitando contaminação cruzada;
• Proceder à leitura;
• Aparecimento de uma coloração tijolo (marrom avermelhada) na tira indica teste peroxidase; positivo, sem alteração na coloração da tira considerar resultado negativo para peroxidase.

O que indica o teste de fosfatase no leite?

Tem por objetivo controlar a eficiência da pasteurização do leite, uma vez que sua presença constitui indicativo de que o leite não sofreu tratamento térmico adequado, no qual o processo se baseia na liberação do fenol de compostos fosforados.

Trata-se de uma enzima hidrolítica de presença normal no leite cru e destruída pelo calor produzido no processo de pasteurização (72ºC/ 15 segundos). Cabe ressaltar que a resistência ao calor da enzima fosfatase é ligeiramente superior à das bactérias patogênicas que possam existir no leite.

Resultados do teste de fosfatase no leite

O p-nitrofenilfosfato é hidrolisado a fim de formar p-nitrofenol e fosfato, na presença do tampão AMP (aminimetil-propanol). O nitrofenol formado possui coloração amarela. Portanto, espera-se encontrar resultado positivo para fosfatase apenas para o leite cru, devendo o resultado necessariamente ser negativo para os leites pasteurizado e UHT.

Como realizar o teste de fosfatase no leite?

Assim como na peroxidase, o teste de fosfatase também tem as metodologias tradicional e alternativa.

Metodologia tradicional teste de fosfatase no leite

Para realizar a análise serão necessários os seguintes materiais e reagentes: tubo de ensaio, pipetas graduadas de 1 mL, pera de sucção, espátula, banho-maria a 37º C, reagente para fosfatase.

Procedimento de análise:

• Retirar da geladeira o reagente para fosfatase (já preparado);
• Homogeneizar o frasco, com inversões;
• Homogeneizar a amostra com espátula;
• Colocar 3 gotas (0,1 mL) de leite em um tubo de ensaio com o auxílio de uma pipeta graduada e pera de sucção;
• Pipetar com uma pipeta graduada e pera de sucção 1 mL de reagente para teste fosfatase;
• Incubar por 3 minutos em banho-maria à 37º C;
• Observar a coloração: amarelo fosforescente indica resultado positivo para fosfatase, e incolor indica resultado negativo para fosfatase.

Metodologia alternativa teste de fosfatase no leite

• Deixar as tiras e a amostra adquirirem temperatura ambiente;
• Homogeneizar a amostra com espátula;
• Imergir a tira reagente na amostra de leite durante 10 segundos;
• Atentar para que a tira não entre em contato com nada, evitando contaminação cruzada;
• Aguardar de 2 a 3 minutos;
• Realizar a leitura da tira;
• Aparecimento da cor amarela indica fosfatase positiva. Incolor/Amarela Pálida, indica fosfatase negativa.

Abaixo imagem do teste de fosfatase:

Referências 

BEHMER, A. M. L. Tecnologia de leite, Livraria Nobel S/A, São Paulo-SP, 1982, 12° edição, 320p, p.108-109. A reference method for measurement of alkaline phosphatase activity in human serum. Study group on alkaline phosphatase. Clin. Chem, 29: 751, 1983.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Instrução Normativa 68 de 12/12/2006. Métodos analíticos oficiais Físico-Químico para controle de leite e produtos Lácteos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil – Cap. Métodos qualitativos.