Este texto é a parte da palestra apresentada pelo Dr. Ronaldo Cerri da University of British Columbia, do Canadá, no XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos, realizado em Uberlândia de 17 e 18 de março de 2016.

Inflamação, estresse e doenças

A queda na fertilidade da vaca de leite atual tem, provavelmente, origem multifatorial e está associada à alta produção de leite (Lucy, 2001; Santos et al., 2004). A associação entre a baixa fertilidade e o aumento da produção podem ser considerados resultados das mudanças homeoréticas necessárias para sustentar a produção de leite, o que afeta diretamente os tecidos reprodutivos. A maior produção de leite está associada às mudanças fisiológicas que podem reduzir a fertilidade, tais como o agravamento do balanço energético negativo (Wathes et al., 2007), concentrações plasmáticas de progesterona e estradiol menores (Wiltbank et al., 2006), e interrupção do eixo do hormônio de crescimento-fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1, que ocorre no fígado (Kobayashi et at., 1999).

Infelizmente, os mecanismos que levam a essa perda embrionária e fetal não são conhecidos no nível molecular. Sartori et al. (2002) observou que novilhas e vacas secas produziram um número maior de embriões de boa qualidade que vacas em lactação, em estudo realizado com ovulação única. Durante experimentos de transferência de embriões, foi relatado que as taxas de prenhez são mais baixas quando as receptoras são vacas em lactação, comparado com vacas não lactantes ou novilhas (Hasler, 2001; Chagas e Silva et al., 2002; Wilson et al., 2006). Juntos, esses estudos sugerem que a lactação pode reduzir a qualidade tanto dos embriões como do endométrio.

Vacas de leite em lactação são submetidas a vários desafios, incluindo os metabólicos e ambientais, especialmente durante o período imediatamente após o parto. Estudos epidemiológicos demonstraram que de 40–60% das vacas sofrem um ou mais episódios clínicos de doença durante os primeiros 60 dias após o parto (Santos et al., 2010). Acredita-se que esse número alarmante de distúrbios de saúde, que provavelmente mascaram um número ainda maior de doenças subclínicas, está associado às exigências energéticas para a produção de leite e ao consequente estresse metabólico.

A drástica redução do desenvolvimento embrionário, das taxas de concepção e aumento das perdas de gestação (Santos et al., 2010) em vacas que vivenciaram um ou mais distúrbios de saúde é uma área mal compreendida e está diretamente relacionada às falhas reprodutivas em gado de leite.

O perfil de expressão dos genes durante o início do desenvolvimento embrionário foi amplamente descrito para camundongos (Zeng et al., 2004; Wang et al., 2013), mas apenas recentemente foi estudado em bovinos (Vallée et al., 2009). A superabundância de genes e de transcritos expressos diferentemente ao passarem do estágio de oócito para o de blastocisto enfatiza a complexidade das rotas de sinalização necessárias para que o desenvolvimento embrionário seja exitoso. Da fertilização ao final da gestação, diversas moléculas e sistemas trabalham aparentemente em sincronia para preparar o útero para receber e manter o embrião. O interferon-tau, que é sintetizado pelas células do trofectoderma do embrião, é essencial para manter o corpo lúteo durante a gestação (Hansen et al., 1985). Ele induz uma série de mudanças no útero ao promover a expressão dos genes estimulados pelo interferon (Spencer et al., 2008). Esses genes, relacionados à remodelação, adesão e invasão, orientação e polarização celular, angiogênese e transportadores de glicose e lipídeos, são ativados pela gestação e pela progesterona (Bauersachs et al., 2006; Forde et al., 2010). Entretanto, há poucas informações sobre as mudanças moleculares causadas pelo estresse crônico e pela inflamação no endométrio e no concepto. Foram descritas mudanças na expressão gênica do endométrio e do concepto (Cerri et al., 2012) causadas exclusivamente pela lactação. Pode-se identificar novos genes relacionados com o desenvolvimento embrionário (DKK1, RELN, PDK4), especialmente com células B e γδ T (IGHG1, IGLL1, IGK, e TRD). Essas descobertas expandiram o entendimento sobre os mecanismos que estão possivelmente relacionados com perdas embrionárias.

Entender a complexa interação da lactação, o meio ovariano contendo esteroides, a condição de saúde e a condição de estresse/inflamação são componentes essenciais para solucionar o problema das perdas de embriões resultantes do desenvolvimento uterino subótimo. A vaca de leite é um modelo muito bom para estudar condições relacionadas ao estresse metabólico e a distúrbios crônicos de saúde, normalmente observados no período após o parto. A grande ocorrência de perdas embrionárias observadas em vacas de leite podem ajudar a melhorar muito o conhecimento de como o concepto e o endométrio se modificam para se adaptarem a condições adversas.

Estresse e inflamação

O conceito de estresse está associado ao fracasso em expressar o potencial genético e a incapacidade do animal se relacionar positivamente com o ambiente. Atualmente, o estresse está intimamente relacionado com a subfertilidade, tendo sido estudado como um fator que influencia negativamente a eficiência do gado de leite (Dobson & Smith, 2000). Nos bovinos, pode ocorrer uma expressão combinada de dois tipos de estresse, físico (extremos de temperatura, privação de alimento e/ou de água, choques elétricos, cirurgia, dor e doenças) e psicológico (p. ex., medo, mudanças na rotina e/ou no ambiente, inserção em um novo grupo, isolamento) (Grandin, 1997, 1998; Lynch, 2010). Independentemente, a resposta neuroendócrina estimulada por um fator estressante leva à ativação dos eixos hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) e simpático-adrenomedular (SAM), bem como à liberação de glicocorticoides (p. ex., cortisol) e catecolaminas (adrenalina e noradrenalina).

O estreito relacionamento do eixo hipotalâmico-pituitário (HP) com o sistema nervoso central (SNC), bem como o controle exercido por seus hormônios sobre diferentes sistemas fisiológicos, demonstram a importância desse eixo em resposta ao estresse. Ao mesmo tempo, reconhecer a importância do eixo HP sobre a fisiologia da reprodução nos leva a considerar que toda resposta ao estresse poderia interferir no controle neuroendócrino da reprodução (Moberg, 1985). Os efeitos do estresse sobre o tecido reprodutivo foi apontado como um fator de interferência sobre o crescimento folicular, a ovulação, o padrão de liberação dos hormônios reprodutivos e comportamento estral nas vacas de leite (Morris et al., 2011).

Um ciclo ovulatório satisfatório está associado a uma série de eventos neuroendócrinos executados pelo eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal. Durante a fase folicular, o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) controla a liberação dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), responsáveis pelo recrutamento de novos folículos e por mantê-los em crescimento, respectivamente. O crescimento folicular leva ao aumento da concentração do estrogênio (E2), produzindo um feedback positivo no hipotálamo, seguido por um pico pré-ovulatório de GnRH e LH (Hafez, 2004). A principal influência do estresse sobre a atividade ovariana é a redução dos pulsos de GnRH/LH, seguido do suporte inadequado de LH para o folículo. Portanto, haverá um folículo crescendo lentamente bem como uma diminuição da liberação de E2 e, consequentemente, efeitos sobre a ovulação, como ausência ou atraso (Dobson & Smith, 2000).

Nesse contexto, Morris et al. (2011), considerando que a claudicação é um fator de estresse, demonstrou que 21% das vacas mancas deixaram de expressar estro ou de ovular. Além disso, 29% das vacas mancas não foram capazes de produzir um folículo funcional em resposta ao estímulo hormonal exógeno. Eles consideraram a possibilidade dessas falhas estarem associadas à redução na frequência das pulsações de LH, a concentrações mais baixas de estradiol ou à resposta ao estradiol e à ausência de picos de LH. Dobson & Smith (2000) apoiam essa ideia. Eles demonstraram que quando o eixo HPA é ativado por condições estressantes, a ativação do hipotálamo e da glândula pituitária produz uma pulsação menor de GnRH/LH, expondo o folículo ovariano a um suporte inadequado de LH.

Diferentes situações podem levar a diferentes interferências sobre o controle GnRH/LH, como por exemplo, durante estresse crônico e claudicação severa, quando a frequência do pulso de GnRH/LH virá estimular o crescimento folicular, porém de maneira insuficiente para impulsionar o crescimento durante os estágios finais e a ovulação. Outra situação está associada à ocorrência de cistos ovarianos, quando a frequência dos pulsos leva o folículo a alcançar diâmetros maiores, porém não rápido o suficiente para sincronizar adequada produção de E2 com o pico de LH, o que causa falha da ovulação (Dobson & Smith, 2000).

Além dos efeitos sobre o ovário, o agente estressante pode interferir na eficiência reprodutiva por afetar o ambiente uterino e o desenvolvimento do concepto através de processos infecciosos e suas complexas respostas imunológicas. Por exemplo: ao enfrentar um desafio imunológico, citoquinas pró-inflamatórias são liberadas, como por exemplo, o fator de necrose tumoral α (TNFα), dando suporte à resposta imunológica. Por outro lado, o TNFα afeta o funcionamento uterino por desempenhar um importante papel na regulação da produção de PGF2α (Miyamoto et al., 2000). Skarzynski et al. (2000) sugeriu que, a ação do TNFα sobre as células do estroma uterino que produzem PGF2α pode desencadear a luteólise em bovinos, seguida de um feedback positivo entre a PGF2α e a ocitocina luteal. Dessa forma, níveis altos de TNFα poderiam ser seguidos de níveis suficientemente altos de PGF2α, levando à luteólise e consequentemente à perda de embriões nos seus estágios iniciais no caso de vacas prenhas (Staples et al., 1998).

Outras citoquinas pró-inflamatórias, bem como interleucinas (IL-1 e IL-2), podem ser expressas no endométrio e também têm sido consideradas fatores luteolíticos consequentes de processos infecciosos. Bany & Kennedy (1995) apresentaram evidências de que a IL-1 induz a produção de prostaglandinas ao aumentar a expressão do ciclooxigenase (COX-2), uma importante enzima envolvida na síntese da PGF2α. Além disso, Leung et al. (2000) mostrou que a IL-2 tem grande capacidade de estimular a PGF2α durante o final da fase lútea, capacidade essa não verificada dias mais tarde, quando os receptores de ocitocina já estavam mais ativos; nessa fase houve um efeito mais pronunciado da produção da prostaglandina E2 (PGE2). Portanto, o efeito do estresse sobre o controle neuroendócrino no ovário é uma área amplamente estudada, o que não é o caso dos efeitos sobre o ambiente uterino, mais especificamente sobre a expressão genética no nível do endométrio.

Da mesma forma como não existe uma definição simples de estresse, também não é fácil definir se o estresse é crônico ou agudo, principalmente pelo fato de haver diferentes tipos de agentes de estresse. Porém, ao considerarmos o estímulo estressante clássico sobre os eixos HPA e SAM, verificamos que o estresse crônico está ligado à alta reatividade do eixo HPA e, consequentemente, aos altos níveis de cortisol, conhecido por resposta passiva. Por outro lado, respostas agudas a agentes estressantes estão associadas à alta reatividade do eixo SAM através da liberação de catecolaminas, conhecidas como resposta ativa ou "ataque/fuga ativa" (Koolhaas et al., 1999; Cohen, 2000; Susan & Caryl, 2007).

Outra forma de estresse que pode ser classificada como aguda ou crônica é a inflamação. Nesse caso, o estresse está associado principalmente às citoquinas e às proteínas da fase aguda (PFA) que podem ativar o eixo HPA direta ou indiretamente e estimular a resposta clássica ao estresse, que leva à liberação de cortisol. Portanto, inflamações crônicas são caracterizadas por um aumento moderado porém constante de citoquinas e de PFA. Por outro lado, a inflamação aguda está associada a um aumento significativo no nível plasmático de citoquinas pró-inflamatórias e de outros mediadores imunológicos, inclusive de PFA (Andreasen et al., 2008).

Considerando-se que as respostas às inflamações levam ao aumento das concentrações plasmáticas de cortisol como forma de feedback para bloquear a resposta imunológica e caracterizando uma resposta a um estresse, alguns estudos avaliaram o relacionamento entre a resposta inflamatória e parâmetros reprodutivos, bem como a qualidade e o desenvolvimento de oócitos e embriões, do ambiente uterino e da função ovariana. Após um desafio imunológico com bactérias Gram-negativas ou pela infusão de endotoxinas, houve a liberação de citoquinas IL-1, IL-6 e do fator de necrose tumoral TNF-α, bem como de PGF2α e de óxido nítrico (NO), além de outros mediadores imunológicos. Nesse contexto, desempenhos reprodutivos menores podem estar associados ao fato de que o TNF-α interfere na maturação de oócitos em bovinos (Soto et al., 2003). Além disso, estudos feitos in vitro demostraram que o TNF-α, a PGF2α e o NO interferem no desenvolvimento dos embriões e que estes apresentaram aumento no número de células apoptóticas e desenvolvimento insatisfatório até a fase de blastocisto (Pampfer et al., 1994; Chen et al., 2001; Soto et al., 2003).

A resposta imunológica é mediada por uma complexa rede de sinais entre os sistemas nervoso, endócrino e imunológico. Portanto, assim como ocorre no controle reprodutivo endócrino, fatores estressantes podem afetar a resposta imune através da ativação dos eixos SAM e HPA, bem como seus hormônios, catecolaminas e glicocorticoides, respectivamente. A modulação imunitária feita por esses hormônios sobre as células de defesa podem ocorrer diretamente, através de receptores, ou indiretamente, através da indução da desregulação da liberação de citoquinas (Glaser & Kiecolt-Glaser, 2005), levando a mudanças na migração celular, à secreção de citoquinas e à proliferação celular (Madden & Livnat, 1991).

As células de defesa são muito sensíveis ao aumento de glicocorticoides, e isso pode ser verificado pelo aumento na taxa de circulação periférica após exposição a esses, o que leva à leucocitose, caracterizada por neutrofilia e linfopenia.