Uso da citometria de fluxo para determinar a contagem bacteriana total do leite

A Instrução Normativa 51/2002 trouxe diversas vantagens e desafios para o setor leiteiro, entre os quais se destaca a necessidade de realização de análises de composição, contagem de células somáticas e de contagem bacteriana total (CBT) das amostras de leite dos produtores brasileiros. Considera-se um desafio em função do grande número de produtores existentes e da capacidade laboratorial instalada. Para atender a demanda crescente foi criada a Rede Brasileira de Laboratórios de Análise de Qualidade do Leite (RBQL), cuja estrutura laboratorial disponibiliza análises automatizadas e com alto rendimento analítico.

Para validar a metodologia automatizada de CBT foram desenvolvidos recentemente estudos na Clínica do Leite - ESALQ - USP, nos quais foram avaliados aspectos relacionados com a conservação da amostras e a correlação entre o método automatizado e o padrão. Um dos objetivos da pesquisa foi o de determinar a possibilidade de utilizar apenas uma única amostra para as análises de CCS, composição e CBT para atender aquelas requeridas pela IN 51, o que reduziria substancialmente os custos com material de coleta.

Em um primeiro estudo, avaliou-se o efeito da temperatura de armazenamento, da idade das amostras e do tipo de conservante usado para a CBT. Os pesquisadores testaram amostras de leite em três diferentes temperaturas (0 ^oC - congelado, 7 ^oC - resfriamento e 24^oC - ambiente), e quatro tempos entre a coleta e a análise, considerada como idade da amostra (um, três, cinco e sete dias). Adicionalmente, foram testados três conservantes (bronopol, azidiol e sem conservante) sobre os resultados da CBT do leite cru.

Os resultados deste primeiro estudo indicaram que é necessária a coleta de duas amostras para fins de análise para atendimento da IN 51, sendo uma destinada a CCS e composição, cujo conservante usado é o bronopol e outra para a CBT, conservada com azidiol. Segundo os pesquisadores, a amostra para CBT poderá ser analisada em até sete dias após a coleta, desde que mantida sob refrigeração a 7 ^oC. É importante destacar que para a CBT existe a necessidade de refrigeração e uso de conservante para a amostra de leite, visto que se a amostra for conservada apenas com o azidiol e em temperatura ambiente ocorre aumento da CBT.

Foi verificado também que se deve evitar o aquecimento ou o congelamento da amostra para CBT, assim como garantir a adição do azidiol para uma adequada conservação. Estes resultados levantam questões sobre os cuidados para garantir que a amostra não se congele durante o transporte, o que poderia acontecer em situações onde existe excesso de gelo químico nas caixas de transporte.

O segundo estudo avaliou a correlação entre o método de referência para a CBT e o método automatizado (citometria de fluxo). O objetivo foi validar a metodologia automatizada e desenvolver equações para transformação dos resultados obtidos pela análise automatizada, cujos resultados são expressos em contagem individual de bactérias (CIB), em unidades formadoras de colônias (UFC), a qual é usada para o método padrão de contagem bacteriana total. Para tanto foram coletadas amostras de leite nas duas principais estações do ano (estação seca e das águas), uma vez que em função das condições climáticas diferenciadas poderia ocorrer influência sobre os resultados de CBT.

As amostras coletadas foram analisadas simultaneamente pelo método de referência (CBT) pelo método automatizado (Bactocount). Os resultados obtidos foram utilizados para desenvolver equações de regressão relacionando os dois métodos. Desta forma, foi determinada a utilização de uma única equação de regressão para o ano todo com coeficiente de correlação de 0,81; independentemente da estação do ano. Os resultados deste estudo apontam que o método automatizado de análise de CBT do leite cru pode ser calibrado para expressar os resultados em UFC e desta forma, pode ser utilizado como método alternativo no monitoramento da qualidade microbiológica do leite para fins de análises previstas pela IN 51.

Fonte: Cassoli, L.D. - Dissertação de Mestrado em Ciência Animal e Pastagens ESALQ, 2005.