O Brasil se posiciona, atualmente, como um dos líderes na pesquisa de biotecnologias de reprodução assistida, como a inseminação artificial - IA, a múltipla ovulação e transferência de embriões - MOTE e a fertilização in vitro - FIV (GARCIA, 2009). Com o advento destas, foi possível a utilização de novas ferramentas no processo de melhoramento animal.

A tecnologia da MOTE promove maior intensidade de seleção, intervalo de geração reduzido e maior acurácia das estimativas de valores genéticos (KINGHORN et al., 2006). Porém, uma das principais desvantagens está associada ao custo da técnica que limita a sua utilização. A despesas estão, principalmente, entrelaçadas aos gastos hormonais, técnica cirúrgica de coleta e inovulação e criopreservação dos embriões. Os gastos hormonais estão, em parte, relacionados a uma grande variabilidade individual no resultado da MOTE. O chamado “efeito intrínseco ou individual” das doadoras está relacionado ao fato de que algumas fêmeas respondem melhor do que outras aos protocolos hormonais. Este efeito também está associado ao momento da dinâmica folicular no início do protocolo superovulatório e também a ocorrência da regressão prematura de corpos lúteos – RPCL (BALDASSARRE, 2008).

Figura 1 - Imagem ultrassonográfica (modo B) de ovário caprino. Medição (cm) de folículo persistente anovulatório e corpo lúteo cavitário ao lado.



Como já bem fundamentado, os protocolos de superovulação melhor sucedidos são baseados na utilização do hormônio folículo estimulante - FSH, o qual são administradas de seis a oito aplicações em intervalos de 12 horas, devido a meia-vida curta hormonal, durante três ou quatro dias consecutivos (COGNIÉ et al., 2003; FONSECA, 2005; CERVANTES et al., 2007). Por outro lado, a superovulação também pode ser atingida com uma dose única de gonadotrofina coriônica equina - eCG, o que é uma vantagem distinta quando a mão de obra local é um fator limitante ou os animais não estarem acostumados ao manejo (ESPINOSA-MARQUEZ et al., 2004). Porém, a meia-vida prolongada da eCG pode ser tornar uma desvantagem, visto que o crescimento folicular muitas vezes permanece estimulado após a ovulação, levando a formação de folículos persistentes anovulatórios e a manutenção de elevadas concentrações sanguíneas de estradiol (E2), durante a fase lútea inicial. O pico de E2, cerca de quatro dias após o início do estro, aumenta a sensibilidade uterina a ocitocina e induz a síntese e liberação de PGF2α, resultando na RPCL (ARMSTRONG et al., 1983; ARMSTRONG et al., 1987).

Tem sido postulado que a falha prematura luteal entre os três e quatro dias após o acasalamento causa uma redução na concentração de progesterona - P4 que é prejudicial para a migração dos embriões através da tuba uterina (ISHWAR E MEMON, 1996). Este fato, compromete a qualidade do embrião e sobrevivência embrionária refletindo na baixa coleta de estruturas viáveis para transferência. Além disso, já é descrito que a liberação precoce de PGF2α também pode funcionar indiretamente como um fator tóxico para os embriões bovinos (Hernandez-Fonseca et al., 2000) e ovinos (Costine et al., 2001).

Figura 2 - Imagem ultrassonográfica (modo B) de ovário caprino. Medição (cm) de possível folículo persistente após estímulo superovulatório com eCG.



Nas últimas décadas, pesquisadores vêm demonstrando que a incidência de RPCL em doadoras superovuladas pode ser anulada/reduzida pela imposição de diversas ferramentas dentro de protocolos de MOTE. Estudos realizados por Espinosa-Marquez et al. (2004) relataram que a administração de acetato de fluorogestona - FGA por meio da esponja intravaginal imediatamente após o estro não impediram a RPCL, que ocorreu em 61,5% dos caprinos do grupo testado, corroborando com a etiologia já descrita anteriormente. Entretanto, a administração de FGA em cabras superovuladas facilitou a recuperação de embriões normais, mesmo em fêmeas com RPCL. Por isso, foi proposto que a maior perda embrionária em cabras, do grupo controle, com luteólise prematura decorreu devido à falta de apoio progestacional nos primeiros dias do embrião no ambiente uterino. Com relação ao efeito tóxico da PGF2α, o mesmo estudo obteve uma presença satisfatória de embriões normais do grupo tratado e que sofreram luteólise prematura, sugerindo que a PGF2α possa ser menos tóxica para embriões caprinos. Cervantes et al. (2007) também encontraram resultados semelhantes na administração de FGA visando melhor recuperação de embriões viáveis. Além disso, o uso das esponjas intravaginais com FGA ofereceram a vantagem da fácil aplicação, evitando o manuseio excessivo e o estresse subsequente dos animais anterior a coleta de embriões.

Figura 3 - Imagem ultrassonográfica (modo B) de ovário caprino. Crescimento folicular homogêneo após estímulo superovulatório com FSH.



Outra ferramenta disponível para diminuir as consequências da RPCL, é baseada no uso de inibidores da prostaglandina sintetase (ex.: síntese de PGF2α). No passado, pesquisas já demonstravam o efeito benéfico de drogas como o ácido meclofenâmico e a indometacina. Mas, somente Gilbert et al. (1990) realizaram o primeiro estudo demonstrando o potente efeito inibidor das ciclooxigenases a partir do flunixin-meglumine. Diversos autores relataram com sucesso doses intramusculares de 1,1 a 2,2 mg/kg de Flunixin, administradas em intervalos de 12 a 24 horas entre os dias 3 e 7 após a remoção do dispositivo intravaginal (Sales et al., 2002; Lopes Jr. et al., 2004). Battye et al. (1988) ainda demonstraram a funcionalidade dos corpos lúteos nos animais tratados com flunixin, através da concentração plasmática de P4 e morfologia luteal pela laparoscopia. Nos animais do grupo controle, foi observado um perfil superior de síntese e secreção de PGF2α, menor concentração de P4 e comprometimento morfológico dos corpos lúteos.

Outro estudo interessante foi apresentado por Salles et al. (1998) em que foi testado a eficiência na redução da frequência de aplicações do flunixin meglumine, com relação à taxa de RPCL e a qualidade embrionária. A percentagem de corpos lúteos regredidos para os tratamentos com uma única aplicação diária foi superior (22,5%) em relação ao tratamento com duas aplicações diárias (0%). Este resultado levou a supor que a duração do efeito do flunixin meglumine, em cabras, fosse inferior a 24 horas, tornando o regime de uma aplicação diária ineficiente em inibir totalmente a RPCL. Entretanto, as médias de embriões obtidos e viáveis não diferiram entre os tratamentos. Assim, visando simplificar e reduzir os custos da utilização do tratamento anti-luteolítico em cabras, indicou-se a adoção da dose de 1,1mg.kg de PC, em uma única administração diária durante o período requisitado.

O uso de agentes luteotróficos para promover a luteinização ou ovulação de folículos persistentes em protocolos de superovulação, principalmente os baseados na eCG, são bem discutidos na literatura. Saharrea et al. (1998) superovularam cabras com 1.000 UI de eCG, 48 horas antes da retirada da esponja contendo FGA, e administraram salina (controle), 50 μg de GnRH ou 1000 UI de hCG 84 horas após o início do estro. Com base na concentração plasmática de P4 e no número de corpos lúteos presentes no dia 3 e 6 após o estro, os autores reportaram um percentual de RPCL de 57, 37 e 0% nos grupos tratados com salina, GnRH e hCG, respectivamente. Deste modo, a administração de GnRH ou hCG de 3 a 4 dias após o início do estro seria uma opção de inclusão no protocolo por induzir a ovulação ou luteinização dos folículos persistentes, estimulados pela meia-vida longa da eCG. Já Shabankareh et al. (2012) objetivando avaliar a eficácia da hCG em ovelhas superovuladas com eCG relataram que apenas uma aplicação de 500 UI no D0 (retirada da esponja), foi eficaz em se evitar a RPCL. Outrossim, no grupo testado, houve a formação de mais corpos lúteos e concentrações plasmáticas de progesterona superiores.

Figura 4 - Imagem ultrassonográfica (modo Color Doppler) de ovário ovino. Vascularização de diversos corpos lúteos após estímulo superovulatório. O uso desta ferramenta pode auxiliar na compreensão da RPCL. 




É descrita a possibilidade de controle do período de ação da eCG por meio da imunoneutralização/administração de anticorpos anti-eCG no final do estro. Bainbridge et al. (1995), após aplicarem um anticorpo monoclonal para eCG a -72 (junto ao estímulo superovulatório da eCG), 0, 12 e 24h do protocolo, sugeriram que a imunização passiva neutralizava a ação biológica da eCG em cervos. Este, poderia ser um meio de superar alguns dos efeitos negativos do hormônio, como a formação de folículos persistentes anovulatórios.

A inibição da sensibilidade do endométrio uterino à ocitocina, com a administração de interferon também é debatida. Bainbridge et al. (2008) aplicaram, duas vezes por dia, de D2 à D7 do protocolo, 4mg de inteferon-alfa I - IFNα-I recombinante bovino em cervos superovulados com eCG. Os resultados sugeriram que o tratamento com IFNα-1, o sinal embrionário de reconhecimento da prenhez, suprimia a RPCL.

Conforme discutido, a RPCL é um fenômeno comum em cabras e ovelhas superovuladas. Todavia, este fato parece ser negligenciado, já que diversos protocolos de MOTE ainda não utilizam agentes antiluteolíticos (anti-inflamatórios) ou luteotróficos (hCG, GnRH, LH) ou ainda, progestágenos exógenos, como indicado pela literatura. Desde modo, a revisão procurou fornecer aos leitores a compreensão e importância da RPCL, assim como pontuar ferramentas para controle da mesma. É esperado o estímulo científico para um maior número de estudos na área e a adequação dos protocolos de MOTE, divulgados a campo, buscando maiores índices de eficiência na produção de embriões em pequenos ruminantes.

Referências bibliográficas:

ARMSTRONG, D.T.; PFITZNER, A.P.; WARNES, G.M.; RALPH, M.M.; SEAMARK, R.F. Endocrine responses of goats after induction of superovulation with PMSG and FSH. J Reprod Fertil, v.67, p.395–401, 1983.

ARMSTRONG, D.T.; KIEHM, D.J.; WARNES, G.M.; SEAMARK, R.F. Corpus luteum (cl) failure and embryonic loss in superovulated goats. Theriogenology, v.27 p.207, 1987.

BALDASSARRE, H. Coleta, Conservação e Transferência de Embrião. In: AISEN, E. Reprodução ovina e caprina. São Paulo: Medvet, 2008. 203p.

BATTYE K.M.; FAIRCLOUGH, R.J.; CAMERON, A.W.N.; TROUNSON, A.O. Evidence for prostaglandin involvement in early luteal regression of superovulated nanny goat (Capra hircus). J. Reprod. Fertil., v.84, p.425-430, 1988.

CERVANTES, M.J.; JUÁREZ, M.L.; MEJÍA, V.O.; BERRUECOS, V.J.M.; VERA, A.H.; VALENCIA, J. Use of fluorogestone acetate after breeding to reduce the effect of premature luteal regression in dairy goats when superovulation is induced with FSH. Animal Reproduction Science, v.97, p. 47-54, 2007.

COGNIÉ, Y.; BARIL, G.; POULIN, N.; MERMILLOD, P. Current status of embryo technologies in sheep and goat. Theriogenology v.59, p.171-188, 2003.

COSTINE B.A.; SAYRE, B.L.; INSKEEP, E.K. Embryotoxicity of regressing corpora lutea in ewes. Reproduction 2001;122:883–7. Hernandez-Fonseca HJ, Sayre BL, Butcher RL, Inskeep EK. Embryotoxic effects adjacent and opposite to the early regressing bovine corpus luteum. Theriogenology 2000;54:83–91.

ESPINOSA-MÁRQUEZ, M.C.; VALENCIA, J.; ZARCO, L.; ESCOBAR-MEDINA, F.J.; COLINA-FLORES, F.; ARECHIGA-FLORES, C.F. Effect of fluorogestone acetate on embryo recovery and quality in eCG-superovulated goats with premature luteal regression. Theriogenology, v.62, p.624–630, 2004

FONSECA, J.F. Estratégias para o controle do ciclo estral e superovulação em caprinos e ovinos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 16, 2005, Goiânia, Anais..., Goiânia, 2005.

GARCIA, J.F. Contribuição Brasileira à Produção Mundial de Embriões Animais. Revista CFMV, n.46, p. 80-81, 2009.

GILBERT, D.E.; COONROD, S.A., WHITING, C.J., PASHEN, R.L. Comparison of a progesterone intravaginal device (CIDR. TM.) with flunixin meglumine (finadyne TM) for reducing the effects of corpus luteum regression in the goat. Theriogenology 33, 230 (abstract), 1990.

ISHWAR, A.K.; MEMON, M.A. Embryo transfer in sheep and goat: a review. Small Rumin. Res. V,19v p.35–43, 1996.

LOPES JR, E.S.; TEIXEIRA, D.I.A.; LIMA-VERDE J.B. et al. Uso do flunixin meglumine na prevenção da regressão lútea prematura em cabras submetidas a tratamento superovulatório. Vet News, v.68, p.7-8, 2004.

KINGHORN, B.; VAN DER WERF, J.; RYAN,M. Melhoramento Animal : Uso de novas tecnologias. Piracicaba: FEALQ, 2006. 367p.

MARTINS FILHO, R.; MARTINS, J.A..M. Biotecnologias Reprodutivas Aplicadas ao Melhoramento Genético Animal. In: NUNES, J.F. Biotécnicas Aplicadas a Reprodução de Pequenos Ruminantes. Fortaleza: Tecnograf, 2010. 208p.

RIESENBERG, S.; MEINECKE-TILLMAN, S.; MEINECKE, B. Estradiol 17-b and progesterone in the peripheral blood plasma of goats following superovulation with a single dose of pFSH, hMG or eCG. Small Rum Res., v.40 p.73–82, 2001.

SAHARREA, A.; VALENCIA, J.; BALCÁZAR, A.; MEJIA, O.; CERBÓN, J.L.; CABALLERO, V.; ZARCO, L. Premature luteal regression in goats superovulated with pmsg: effect of hcg or gnrh administration during the early luteal phase. Theriogenology, v.50, p.1039-1052, 1998.

SALES, H.O.; ANDRIOLI, A.; SIMPLÍCIO, A.A.; MEDEIROS, J.N.; MACHADO, O.M. Manual de transferência de embriões em caprinos. Sobral: Embrapa Caprinos, documentos 40, 2002, 64p.