A biotécnica de produção in vitro (PIV) de embriões tem sido descrita como revolucionária desde seu desenvolvimento. Possibilita a aceleração do ganho genético por meio da maximização do número de nascimentos a partir de fêmeas de alto valor genético e da redução do intervalo entre gerações, principalmente, quando doadoras juvenis são utilizadas. Os avanços são alcançados em programas comerciais de multiplicação genética e em apoio a outras biotécnicas, como clonagem e transgenia.

A PIV de embriões ovinos e caprinos se manteve por muitos anos com caráter unicamente experimental, hoje tem conquistado também o mercado comercial. Os números são ainda inferiores aos da espécie bovina, entretanto, a demanda tem incrementado as iniciativas voltadas a melhoria da eficiência dos resultados nestas espécies.

A PIV envolve quatro etapas: (1) a colheita de oócitos primários de folículos antrais; (2) a maturação in vitro (MIV) destes oócitos; (3) a fecundação in vitro (FIV) de oócitos maturados e (4) o cultivo in vitro (CIV) dos embriões produzidos.

A colheita dos oócitos é a primeira etapa do processo. Os métodos utilizados para obtenção deste material genético em pequenos ruminantes foram descritos no artigo "Aspiração folicular em pequenos ruminantes". A qualidade dos gametas colhidos é determinante para o sucesso da PIV. Vários fatores estão envolvidos, entre eles, a saúde da doadora, a fase do ciclo estral (exemplo, folículo em estágio pré-ovulatório apresentam oócitos que já iniciaram o processo de maturação; quando submetidos a PIV apresentam menor viabilidade) e a técnica de colheita (exemplo, a pressão empregada pode remover células circunvizinhas - células da granulosa, e comprometer o processo de maturação do oócitos). Após a obtenção dos oócitos, aqueles que não apresentam expansão das células do cumulus, que possuem no mínimo 3 a 4 camadas de células da granulosa, citoplasma uniformente granulado e com coloração homogênea, nem muito clara e nem muito escura, são selecionados para a maturação.

A etapa de MIV consiste em proporcionar aos oócitos aquisição de competência ao desenvolvimento. Para o sucesso da MIV, os oócitos devem se submeter à maturação nuclear e citoplasmática in vitro. Os meios são geralmente constituído por meio base (TCM-199 - o meio mais empregado) enriquecidos por fonte proteica, fatores de crescimento e hormônios (FSH, LH e 17β-estradiol) e antibióticos. Os oócitos são incubados em estufa com temperatura (38,5 - 39°C) e atmosfera (5% CO2 em ar ou em atmosfera com a concentração de oxigênio reduzida para 7 ou 5%) controladas.

A FIV pode ser realizada com sêmen fresco ou congelado. O sêmen fresco é utilizado principalmente quando machos de fertilidade comprovada estão disponíveis para a coleta. Sua utilização apresenta os inconvenientes da necessidade de coletar o(s) macho(s) a cada programa de PIV de embriões e da utilização restrita ao grupo que dispõem desses machos. O uso de sêmen congelado/descongelado têm ganhado espaço por facilitar o processo, ademais, há relatos de que poucas diferenças quanto ao número de oócitos fecundados tem sido observadas entre sêmen fresco e congelado/descongelado. Não é incomum o uso de espermatozóides oriundos de uma mistura de ejaculados de 2 a 4 carneiros. Essa estratégia visa evitar baixas taxas de fecundação devido ao possível efeito específico de algum macho, em função da variabilidade existente entre os mesmos. No entanto, a utilização de sêmen de um só macho, para cada conjunto de oócitos, é a recomendada quando a PIV for utilizada comercialmente como procedimento para acelerar o melhoramento genético de rebanhos.

A seleção dos espermatozóides é efetuada pelo método da migração ascendente (Swim-up), ou submetendo os espermatozóides a um gradiente de Percoll (45%/90%). Estas práticas visam a seleção dos espermatozóides com motilidade progressiva contidos no sêmen. A concentração de espermatozóides geralmente utilizada é 1 milhão de células/mL. Os espermatozóides viáveis são então incubados por 10-30 minutos para o processo de capacitação espermática. Este fenômeno leva à reação acrossômica causando a liberação de enzimas proteolíticas que podem ajudar na penetração do espermatozóide no oócito. Qualquer substância que cause a entrada de Ca⁺⁺ dentro do acrossoma espermático e um aumento do pH habilita à capacitação. A heparina pode ser adicionada ao meio para estimular a capacitação e pode também melhorar a penetração no oócito pelo espermatozóide.

Após o tempo de maturação, as células do cumulus que circundam os oócitos são gentilmente removidas e os oócitos colocados em meio FIV, em contato com os espermatozóide já capacidados. Oócitos e espermatozóides são incubados sob temperatura e atmosfera controladas por 15 a 24 horas, antes de serem cultivados in vitro.

O desenvolvimento dos embriões até o estádio de mórula ou blastocisto é desejável para poder selecioná-los antes da transferência em fêmeas receptoras. Embora tenham sido feitos progressos, o cultivo in vitro (CIV) é ainda uma das etapas limitantes na PIV de embriões em pequenos ruminantes. É comum ocorrer bloqueio do desenvolvimento embrionário, por ocasião do 4º ciclo celular (8-16 células), coincidente com o momento da ativação do genoma embrionário. Esse processo ocorre principalmente quando utiliza-se meio sinteticamente definidos. Por este motivo, a incubação dos zigotos em oviduto de ovelhas foi preferencialmente utilizado nos primeiros trabalhos de PIV em ovinos. Associações do meio com cocultivo celular (exemplo, monocamadas de células epiteliais do oviduto) apresentam grandes benefícios para o cultivo in vitro.

Há três sistemas de cultivo rotineiramente usados para PIV de pequenos ruminantes: (1) co-cultivo com células somáticas; (2) condições semidefinidas em meio desenvolvido para as necessidades dos embriões ou; (3) desenvolvimento in vivo no oviduto. A comparação entre co-cultivo e meio semidefinido demonstrou que o tratamento de cultivo não influencia a taxa de desenvolvimento de oócitos ovinos ou caprinos. Todavia, se os sistemas de cultivo não afetam significativamente a produção de blastocistos em pequenos ruminantes, o ambiente do oviduto melhora significativamente a qualidade geral dos blastocistos.

Progressos recentes no conhecimento das necessidades do embrião em desenvolvimento resultaram na criação de meios nos quais os componentes mudam de acordo com as necessidades do embrião. Todavia, as diferenças entre os embriões produzidos in vivo e in vitro mostram que os procedimentos in vitro ainda necessitam de melhorias. Contudo, a demanda por embriões ovinos e caprinos tem estimulado as investigações que buscam maior eficiência nos procedimentos de colheita de oócitos em animais vivos e nos processo de produção in vitro dos embriões destas espécies.

Literatura consultada:

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