Introdução

A neosporose é uma doença parasitária emergente causada pelo protozoário Neospora caninum, associada a problemas reprodutivos e distúrbios neurológicos nos animais, com caráter progressivo, manifestando-se com maior severidade em animais jovens, reconhecida mundialmente como importante causadora de abortamentos em rebanhos ovinos (ANDERSON et al., 2000).

No Brasil a ovinocultura está em crescente expansão, principalmente nos estados onde não havia tradição neste tipo de atividade econômica. Assim, a cadeia produtiva deve atentar para os problemas sanitários, dentre eles os reprodutivos que tem efeito direto sobre a produção e produtividade dos rebanhos. Entre as enfermidades parasitárias da reprodução destaca-se a neosporose, responsável por quadros de abortamento, morte embrionária, malformação fetal e nascimento de cordeiros fracos ou persistentemente infectados (ALMEIDA, 2004).

A presença de anticorpos para N. caninum em amostras de soro, demonstra exposição ao parasita, que pode ser identificada por testes sorológicos tais como a reação de imunofluorescência indireta - RIFI, teste de aglutinação para anticorpos anti-N. caninum - NAT e teste imunoenzimático - ELISA. A RIFI foi o primeiro teste sorológico usado para a demonstração de anticorpos anti-N. caninum e atualmente é muito utilizada para diagnóstico da infecção, constituindo padrão ouro comparada a outros testes (ATKINSON et al., 2000).

No Brasil, as pesquisas com N. caninum estão em fase de levantamentos sorológicos e a soroprevalência é desconhecida em algumas regiões. A falta de informações sobre a epidemiologia do agente tem limitado substancialmente a proposição de soluções objetivas e práticas para prevenir a infecção. Inúmeras são as causas de problemas reprodutivos em ovinos, devendo sempre ser incluído o diagnóstico diferencial para esta enfermidade (MUNHÓZ, 2009).

Ciclo biológico

Em 1998 parte do ciclo biológico de N. caninum foi elucidada e demonstrada pela eliminação de oocistos nas fezes por cães que ingeriram cistos contidos em cérebro de camundongo infectado, concluindo-se que o cão era o hospedeiro definitivo. Recentemente foi observado que o coiote (Canis latrans) também pode eliminar oocistos nas fezes e representar um hospedeiro definitivo (DUBEY, 1999; GONDIM et al., 2004).

O ciclo biológico de N. caninum ainda não está totalmente elucidado, principalmente no que diz respeito à fase intestinal, que compreende a fase sexuada de evolução. Sabe-se que o período pré-patente é de cinco a oito dias após a ingestão dos cistos teciduais (LINDSAY & DUBEY, 2000). O ciclo sexuado ocorre apenas no hospedeiro definitivo, mas os estágios enteroepiteliais no cão ou coiote ainda não foram demonstrados. O cão pode comportar-se como hospedeiro definitivo ou intermediário (GONDIM et al., 2004).

No hospedeiro intermediário ocorrem os estágios assexuados: os taquizoítos e bradizoítos. Há relatos de infecções naturais em cães, bovinos, búfalos, ovinos, caprinos, equinos, raposas, veados, rinoceronte, lhama, alpaca e ratos, experimentalmente foi possível a infecção de gatos, suínos, camundongos, gerbis, coiotes e macacos (ALMEIDA, 2004).

Oocistos liberados no ambiente pelo hospedeiro definitivo se tornam infectantes ao esporular. São ingeridos pelo hospedeiro intermediário (bovinos, ovinos, cães, bubalinos, caprinos e outros) e, na luz intestinal, são liberados os esporozoítos. Estes penetram nas células da parede intestinal passando a se chamar de taquizoítos, que se dividem rapidamente por endodiogenia e podem atingir quaisquer células do organismo do hospedeiro, causando severas lesões em vários órgãos. Com a resposta imune do hospedeiro, os taquizoítos diferenciam-se em bradizoítos, forma de multiplicação lenta contidas em cistos teciduais e uma queda da imunidade do hospedeiro poderia provocar reativação dos bradizoítos e rompimento do cisto. Quando ocorrer a ingestão destes cistos pelo cão ou o coiote, os bradizoítos, que são resistentes às soluções pépticas e ácidas responsáveis pela digestão, iniciarão o processo de penetração no epitélio intestinal dando origem às formas resultantes da multiplicação assexuada e sexuada do parasito. Em seguida, ocorre a liberação de oocistos não esporulados no ambiente, reiniciando o ciclo (DUBEY 1999).

Os taquizoítos localizam-se dentro de um vacúolo parasitóforo no citoplasma da célula hospedeira. Taquizoítos já foram observados em macrófagos, neutrófilos, células do tecido nervoso, hepatócitos, fibroblastos, miócitos, células epiteliais tubulares renais e células endoteliais vasculares (SPEER et al., 1999).

Os oocistos podem ter formato redondo ou ovalado. A parede cística encerra os bradizoítos que podem estar em número de 20 a 100. Os cistos de N. caninum são encontrados em baixo número nos tecidos quando comparado aos de T. gondii. Eles são observados comumente no sistema nervoso, mas já foram encontrados em músculo ocular de potro e músculo de bovino e cão (LINDSAY et al., 1996).

A transmissão de N. caninum pode ocorrer de forma horizontal ou vertical. Na transmissão horizontal, a infecção ocorre por ingestão de água ou alimentos contaminados por oocistos esporulados expostos no meio ambiente por meio das fezes dos hospedeiros definitivos. Já a transmissão vertical ocorre quando a mãe infectada transmite a doença para seus descendentes via transplacentária (GUIMARÃES JUNIOR, 2002).

Epidemiologia

Estudos sobre a soroprevalência de N. caninum na espécie ovina no Brasil e no mundo apresentam menores taxas quando comparados à espécie bovina. A distribuição do parasita é mundial e a infecção já foi relatada nos cincos continentes (DUBEY, 1999). N. caninum em ovinos foi inicialmente diagnosticado em cordeiro congenitamente infectado na Inglaterra (DUBEY, 1990).

Na Inglaterra e País de Gales, 660 amostras de soro colhidas de ovelhas que haviam abortado foram submetidas à RIFI (ponto de corte 1:50). Destas, apenas três (0,45%) foram positivas para a neosporose (Helmick et al., 2002). Porém, nestes dois países, estima-se que a enfermidade seja causa de abortamento em bovinos em 12,5% dos casos (DAVISON et al., 1999). Já na Califórnia, a neosporose foi apontada como a principal causa de abortamentos em bovinos de leite (ANDERSON et al., 2000).

Kobayashi et al. (2001) constataram no Japão o primeiro caso de infecção natural pelo N. caninum acometendo ovelha prenhe e seus dois fetos gêmeos. Em Guarapuava/PR, foi realizado estudo soro-epidemiológico utilizando a RIFI (ponto de corte de 1:100) em 305 amostras de soro de ovinos, onde 9,5% dos animais foram soropositivos para N. caninum (Romanelli, 2002). No estado de São Paulo Figliuolo et al. (2004), examinaram pela RIFI (≥50) 597 amostras de soro sanguíneo de ovinos, observando soropositividade de 9,2% para anticorpos contra N. Caninum.

A prevalência de anticorpos anti-N. caninum em ovinos naturalmente infectados na região Norte do estado do Paraná mostrou que dos 381 soros ovinos testados obteve-se positividade em 13,91% dos animais (MUNHÓZ, 2009).

Patogenia

A patogenia da neosporose depende do equilíbrio entre a capacidade dos taquizoítos em penetrar e se multiplicar nas células e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferação. A invasão da célula hospedeira compreende dois eventos distintos: adesão à superfície da célula hospedeira e o processo de entrada na célula. O evento inicial no processo de adesão é mediado por contato de baixa afinidade, que subsequentemente conduz à secreção de micronemas. Em seguida ocorre ligação mais específica com a superfície da célula hospedeira, e a consequente invasão da célula. Para tanto, é necessário que haja a presença de receptores adequados na superfície da célula hospedeira que forneçam o sinal para a entrada do parasita no citoplasma celular (BUXTON et al., 2002).

Os taquizoítos de N. caninum interagem com a célula hospedeira por meio de mecanismos altamente conservados em todo o filo Apicomplexa. Mas em contraste com outros gêneros desse filo, que exibem considerável especificidade pela célula hospedeira, tanto N. caninum quanto T. gondii podem invadir e se proliferar em diferentes tipos de células de mamíferos, sugerindo assim, que eles possam reconhecer um ou vários receptores na superfície da célula hospedeira, para a adesão inicial e subsequente invasão (BUXTON et al., 2002).

O protozoário atinge células alvo pelas vias sanguíneas e linfáticas, reconhecendo a célula através de invasão ativa por proteínas usadas como receptoras, sendo essa fase classificada por Hemphill et al. (1996) como extremamente rápida, não exigindo mais que cinco minutos. Dentro das células, os parasitas se localizam em uma estrutura denominada vacúolo parasitóforo, que possui tênue camada membranosa, formada pela própria membrana da célula hospedeira, que separa os taquizoítos do citoplasma celular. O parasita provoca mudanças metabólicas nos hospedeiros, favorecendo ainda mais a invasão.

Os taquizoítos se multiplicam no hospedeiro definitivo por endodiogenia, produzindo várias centenas de parasitas em poucos dias após a infecção, provocando grande expansão do vacúolo levando à lise celular. Logo, os taquizoítos estão livres e infectam as células adjacentes iniciando todo o processo novamente, levando à destruição de grande quantidade celular, e lesões significativas (Hemphill e Gottstein, 2006).

Seu estágio latente é representado pelos cistos teciduais, que são constituídos de uma grande parede cística que os protege, contendo bradizoítos, caracterizados pela multiplicação lenta. Podem sobreviver por mais de quatorze dias a quatro graus Celsius. Sabe-se que na forma intestinal o período pré-patente é de cinco a oito dias após a ingestão dos cistos teciduais, mas pouco se sabe sobre sua localização no órgão, ou a respeito das estruturas acometidas e, portanto de sua patogenia (Lindsay e Dubey, 2000).

Ao invadir as células uterinas, o parasita multiplica-se causando destruição local nos tecidos do feto e da mãe e estes tecidos iniciam uma resposta inflamatória. As lesões se estendem para a região corioalantóide entre os cotilédones. Ao mesmo tempo em que essas lesões ocorrem, o parasita também entra na corrente sanguínea e invade outros tecidos, com predileção pelo sistema nervoso central, onde se localiza preferencialmente ao redor dos vasos sanguíneos. A destruição de células fetais, associada à inflamação linfóide, também pode ocorrer em outros tecidos, como coração, músculo esquelético, pulmão e fígado (BARR et al., 1994). N. caninum é capaz de produzir lesões necróticas visíveis em poucos dias, causando morte celular pela multiplicação ativa dos taquizoítos, podendo produzir doenças neuromusculares graves em cães, bovinos e provavelmente em outras espécies, destruindo grande número de células neurais, incluindo nervos craniais e espinhais, afetando assim a condutibilidade dessas células (QUINN et al., 2002).

Se o animal estiver com uma boa resposta imune, os taquizoítos se transformam em bradizoítos, formando os cistos teciduais localizados principalmente no sistema nervoso central. Este estágio é mantido na fase crônica da infecção na qual os animais são assintomáticos. Entretanto, no período de gestação o animal pode apresentar redução da imunidade e a infecção pode ser reativada. Os bradizoítos se transformam em taquizoítos e desenvolvem infecção aguda (BUXTON et al., 2002).

Sinais clínicos

Tanto o hospedeiro definitivo quanto o intermediário podem ser portadores assintomáticos das formas latentes da neosporose, podendo ser reativadas ou exacerbadas por imunossupressão natural ou iatrogênica (GIRALDI et al., 2001).

Em inoculação experimental de ovelhas prenhes, Mcallister et al. (1996) observaram a ocorrência de abortamentos, fetos mumificados, natimortos, nascimento de filhotes fracos e nascimento de filhotes clinicamente sadios, mas congenitamente infectados, dependendo do período de gestação em que a fêmea foi infectada. Ovelhas inoculadas com 65 dias de gestação abortaram, enquanto as que foram inoculadas com 120 dias de gestação pariram cordeiros vivos. As ovelhas infectadas não apresentaram outros sinais clínicos além dos reprodutivos.

Buxton et al. (1998) demonstraram a ocorrência de morte e reabsorção embrionária, além de outras falhas reprodutivas, de acordo com a idade gestacional em que a ovelha foi infectada. O protozoário parece ter predileção pelo epitélio coriônico fetal e vasos sanguíneos placentários, induzindo vasculite, trombose e necrose de placentomas (BUXTON et al., 1998).

Jolley et al. (1999) verificaram que as ovelhas podem abortar repetidamente por neosporose após uma infecção inicial que se torna crônica, mas parece haver certo grau de imunidade contra novos abortamentos ou transmissão transplacentária.

Diagnóstico

Os métodos diretos utilizados no diagnóstico e pesquisa de N. caninum são os exames histopatológicos, imunoistoquímica, isolamento in vitro e in vivo por inoculação do material suspeito em cultivo celular ou em animais de laboratório, detecção do DNA do parasita por PCR e a observação dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloração) por microscopia óptica. Já entre os métodos indiretos estão RIFI, ELISA, NAT e Imunoblotting (IB) que podem detectar anticorpos específicos para N. caninum (BJÖRKMAN & UGLLA, 1999, DUBEY, 2003).

Exames histopatológicos e imunoistoquímicos podem ser realizados a partir de amostras de cérebro, medula espinhal, coração, fígado, músculo esquelético, pulmão, rim, placenta, onde serão identificados os taquizoítos ou cistos de N. caninum. Microscopicamente as lesões são degenerativas e inflamatórias, com áreas de necrose multifocal e infiltradas de células mononucleares (LINDSAY et al., 1993).
Considerando a extensa distribuição de casos de neosporose no mundo, são relatados relativamente poucos casos de isolamento com sucesso. Isto ocorre porque os fetos estão geralmente autolisados e o número de cistos teciduais de N. caninum é relativamente pequeno. Porém, o desenvolvimento de novos métodos para o aumento da concentração do parasita aumenta as chances de obtenção dos isolados (CONRAD et al., 1993).

As técnicas sorológicas são de grande valia, pois podem ser realizadas no animal vivo, apresentam alta sensibilidade e especificidade, e são indicadas para avaliar a exposição e o risco de infecção (GONDIM et al., 2001). As condições experimentais in vitro são muito variadas e, como consequência, o título de anticorpos para N. caninum que determina a infecção em bovinos adultos, ainda não foi padronizado (DUBEY, 2003; GUIMARÃES et al., 2004).

A RIFI foi o primeiro método sorológico a ser utilizado para a pesquisa de anticorpos contra N. caninum (DUBEY et al., 1988). Neste método os taquizoítos de N. caninum são cultivados em diferentes linhagens de células e após processamento adequado são colocados em lâminas de microscopia, que são incubadas inicialmente com soros diluídos e em uma segunda etapa, com antissoro específico, conjugado ao isotiocianato de fluoresceína, para a formação de um complexo imune estável. A detecção da fluorescência dos taquizoítos é feita em microscopia de fluorescência e os soros considerados reagentes (título >25), em uma primeira série de testes, deverão ser posteriormente diluídos na base dois a partir da diluição 1:25, objetivando-se conhecer a maior diluição que ainda gere sinal de fluorescência (titulação), encontrando como diluição final de 1:400 (BJORKMAN & UGGLA, 1999).

Devido à utilização de taquizoítos intactos como antígeno nos testes da RIFI, o teste detecta principalmente anticorpos direcionados para antígenos presentes na superfície celular do parasita. Nas espécies de Apicomplexa, os antígenos de superfície são considerados mais específicos que os componentes intracelulares. Estudos epidemiológicos em diversos hospedeiros demonstram que testes da RIFI para N. caninum apresentam baixa incidência de reação cruzada com outros coccídeos. Isto é particularmente importante em relação a T. gondii. Por essa razão, o teste da RIFI é usado frequentemente como teste de referência para detecção de anticorpos contra N. caninum (DUBEY, 2003) e, portanto, este método foi utilizado no diagnóstico da infecção em várias espécies animais, como: cães, raposas, gatos, bovinos, ovinos, caprinos, búfalos, equinos, roedores e primatas (DUBEY & LINDSAY, 1996; BJÖRKMAN & UGGLA, 1999).

Grande avanço no diagnóstico da neosporose foi a utilização do ensaio imunoenzimático - ELISA (BJÖRKMAN et al., 1994). Enquanto na RIFI são utilizados como antígenos os taquizoítos inteiros, os ELISAs convencionais empregam o antígeno solúvel de taquizoítos (PARÉ et al., 1995; BJÖRKMAN & UGGLA, 1999). Existem outros testes de ELISA, como o competitivo para detectar anticorpos específicos para Neospora em bovinos com anticorpos monoclonais (Mab 4A4-2), direcionado ao antígeno de superfície de 65 kDa, e o Elisa ISCOM que foi desenvolvido com taquizoítos incorporados aos imunoestimulantes (BJÖRKMAN et al., 1994). O teste de ELISA pode ser problemático devido à ampliação enzimática de reações inespecíficas, comumente relacionadas com reações cruzadas com parasitos coccídeos ou com o tipo de antígeno utilizado (CAÑON-FRANCO et al., 2003).

As reações cruzadas observadas no ELISA indireto podem ser decorrentes dos antígenos de N. caninum utilizados nos testes. O ELISA indireto contém antígenos solúveis, com preponderância de antígenos intracelulares, enquanto a RIFI contém taquizoítos fixados intactos, prevalecendo os antígenos de superfície dos parasitos (BJORKMAN & UGGLA, 1999). Evidências apontam que os antígenos mais específicos das espécies do filo Apicomplexa encontram-se na superfície do parasito, podendo explicar a maior especificidade do teste de RIFI para N. caninum sobre o ELISA indireto (BJORKMAN & UGGLA, 1999).

A PCR é uma das técnicas mais importantes da biologia molecular, e representa grande avanço no diagnóstico de várias doenças, pela amplificação de segmentos específicos do DNA. Este método de diagnóstico possibilitou a caracterização molecular do parasita N. caninum (DUBEY; LINDSAY, 1996) e levou a descoberta de que os isolados de N. caninum de cães e de bovinos pertencem a mesma espécie e são geneticamente idênticos (MARSH et al., 1998). As técnicas de PCR desenvolvidas têm como sequência alvo a região ITS1 do DNA ribossômico e a sequência Nc5 do DNA genômico de N. caninum. As técnicas de PCR permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA, mesmo em tecidos que estejam autolisados (COLLANTES-FERNÁNDES et al., 2002). A PCR é altamente sensível e específica para o diagnóstico da neosporose (ELLIS, 1998; ELLIS et al., 1999). Esta técnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N. caninum, tanto em infecções naturais quanto experimentais (HO et al.,1997).

Prevenção e Controle

As medidas de prevenção e controle para neosporose muitas vezes podem tornar-se inviáveis economicamente ou pouco práticas. Ainda não há tratamento efetivo contra a neosporose. Estudos utilizando drogas antiprotozoárias em bezerros infectados têm mostrado algum efeito na diminuição da disseminação do parasita no animal. Já em relação à vacinação, há indícios de que as vacinas inativadas conferem certa imunidade na prevenção da transmissão vertical. Porém, a prevenção do abortamento é discutível e o uso é preconizado apenas para a espécie bovina (DUBEY, 2003).

As medidas de prevenção e controle para a espécie ovina são: uso de receptoras soronegativas na transferência de embrião, uso de maternidades individuais, redução da exposição de cães a fetos abortados e placentas, enviar ao laboratório fetos abortados e placentas para diagnosticar a causa do aborto, reduzir o número de cães coabitando com o rebanho, evitar o acesso de canídeos domésticos ou selvagens a silos e depósitos de ração, e realizar a sorologia do rebanho e dos cães coabitantes (ALMEIDA, 2004).

É inviável descartar todos os animais soropositivos de uma propriedade com alta soroprevalência. Por outro lado, o descarte de animais soropositivos com histórico de abortamento baseado no resultado sorológico de apenas um animal da propriedade também não é uma medida racional, já que muitos animais soropositivos podem ter abortado por outras causas. A avaliação geral da propriedade utilizando análise soroepidemiológica e histórico reprodutivo constituem-se na melhor maneira para iniciar um programa de controle e prevenção da doença. Compra de animais com pelo menos dois resultados negativos para N. caninum também se constitui em medida preventiva (DUBEY, 2003).

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