Diagnóstico molecular de retroviroses animais

Este foi o título do workshop realizado de 13 a 14 de outubro último, na Embrapa Caprinos e Ovinos. O evento, que fez parte do projeto "Diagnóstico do Vírus da Artrite-Encefalite Caprina por RT-nested PCR", apoiado pelo Macroprograma 3 da Embrapa e liderado pela pesquisadora Lucia Helena Sider, contou com a participação dos pesquisadores Alice Andrioli Pinheiro e Raymundo Rizaldo Pinheiro, também da Embrapa Caprinos e Ovinos, e da convidada Ana Paula Ravazzolo, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

O workshop foi iniciado com uma palestra da Dra Ana Paula Ravazzolo, que abordou, de maneira ampla, as retroviroses animais. Seguiram-se então palestras mais focadas no programa de controle e no diagnóstico molecular da artrite encefalite caprina, assuntos que já fazem parte do dia a dia de pesquisas da Embrapa Caprinos e Ovinos. Finalmente, a Dra Ana Paula abordou a metodologia de PCR em tempo real e sua aplicação na avaliação da carga viral da artrite-encefalite caprina.

Os retrovírus são agentes causais de doenças em humanos e animais. O vírus da imunodeficiência humana, o HIV (do inglês: human immunodeficiency virus), é o mais estudado desta família e alguns vírus de animais são considerados modelos para o estudo da patogenia, terapêutica e desenvolvimento de vacinas. Um dos exemplos é o vírus da imunodeficiência felina, o FIV (feline immunodeficiency virus), como modelo para estudos do HIV. Além do FIV, em veterinária, podemos citar o vírus da leucose bovina (BLV - bovine leukemia virus), modelo para leucemia de linfócitos T de humanos (HTLV - human T-cell leukemia virus) e o vírus do adenocarcinoma ovino (JSRV - Jaagsiekte), modelo para certos tipos de câncer de pulmão em humanos.

Em pequenos ruminantes, o vírus da artrite encefalite caprina, o CAEV (caprine arthritis encephalitis virus) e o Maedi Visna de ovinos são retrovírus pertencentes ao mesmo grupo do HIV: os lentivírus. A denominação foi atribuída por tratar-se de doenças de evolução lenta e progressiva, com aparecimento tardio de sinais clínicos (longo período de incubação). Duas propriedades dos retrovírus os tornam únicos: o vírus possui enzimas que transformam o RNA viral em DNA e o DNA gerado se integra ao genoma da célula do hospedeiro. O fato de integrar-se ao genoma, faz com que o animal, uma vez infectado, torne-se portador crônico do vírus e atue como disseminador da infecção, mesmo sem apresentar sintomas clínicos.

A fim de detectar a infecção pelos lentivírus de pequenos ruminantes (SRLV - small ruminant lentivirus), pode-se realizar testes sorológicos para detecção de anticorpos para o vírus e/ou a detecção do genoma viral através de diagnóstico molecular. Os testes sorológicos mais utilizados são a imunodifusão em agar gel (AGID - agar gel immunodifusion), o ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) e o Western blot. No diagnóstico molecular, a principal metodologia utilizada é a reação da polimerase em cadeia ou PCR (polymerase chain reaction). Esta técnica consiste na amplificação do número de moléculas de DNA viral a fim de visualizá-las por eletroforese. O isolamento viral é considerado um excelente teste, mas nem todos os laboratórios dispõem de instalações adequadas para o cultivo celular. Além de ser uma metodologia onerosa, apresentar dificuldades de rotina para evitar a contaminação das amostras e necessitar de um tempo maior para detectar a infecção viral.

A variabilidade das amostras virais e o desconhecimento das variantes presentes no Brasil podem ser fatores limitantes para a detecção do vírus. Neste sentido, estudos que determinem as seqüências de nucleotídeos dos isolados brasileiros são essenciais no estabelecimento de métodos de diagnóstico moleculares e, igualmente, sorológicos. Alguns estudos realizados a partir de isolados das regiões Sul e Nordeste do Brasil apontam para vírus de origem ovina e caprina com especificidade para cada espécie. Diferente do que foi observado na Europa, em que foi possível detectar a infecção cruzada de ovinos e caprinos por CAEV e MVV. Provavelmente relacionada com a criação de ovinos e caprinos no mesmo ambiente ou próximos. Este fato deve ser considerado quando do estabelecimento de programas de controle da infecção.

O programa de controle do vírus da artrite-encefalite caprina da Embrapa Caprinos e Ovinos (PCAEV) existe oficialmente desde 1994. Desde então tem incorporado infra-estrutura, tecnologias e corpo técnico. Além de controlar os níveis de infecção do plantel, o programa tem como objetivos eliminar a doença clínica, reduzir o número de animais infectados e obter animais soronegativos para reposição. Para isto uma série de medidas gerais são adotadas, que vão desde a introdução de fichas de controle sanitário até o abate dos animais, com especial atenção aos bancos de colostro, já que o principal modo de infecção da artrite-encefalite caprina é através do colostro e leite infectados. A monitorização dos animais positivos se dá pela avaliação clínica, pela sorologia, pelo isolamento e mais recentemente por metodologias de diagnóstico molecular baseadas em PCR.

A metodologia de nested PCR para detecção do CAEV (uma variação mais sensível da PCR tradicional) foi desenvolvida pela Dra Alice Andrioli Pinheiro em sua tese de doutorado, em 2001, pela Universidade Federal de Minas Gerais. Desde então, a pesquisadora tem utilizado a metodologia para diagnosticar animais positivos e também estudar a transmissibilidade do vírus pela reprodução (através de sêmen, fluido uterino e embriões). Mais recentemente, em 2007, com a vinda da pesquisadora Lucia Helena Sider para o grupo de pesquisa, foi dado início ao projeto de pesquisa, referido no início, que visa a introdução das reações de RT-nested PCR, que permitem a detecção da forma livre do vírus, o RNA genômico. Além disso, o projeto conta com a colaboração da Dra. Ana Paula Ravazzolo, especialmente para contribuir na avaliação da carga viral.

A PCR em tempo real (real time PCR) é uma das metodologias propostas para quantificação de carga viral e para aumentar a sensibilidade da PCR convencional. Baseia-se na análise da amplificação durante a realização do teste, através da detecção de fluorescência emitida, a qual está incorporada aos produtos da PCR. Os avanços foram significativos em relação à PCR convencional, permitindo análises que, até então, eram semiquantitativas. A quantificação da carga viral é empregada em várias situações: na determinação da eficácia de drogas antivirais, de vacinas e ainda na determinação de uma possível predileção do vírus por determinados órgãos, tecidos ou células. A pesquisadora já trabalhou com a técnica em seu pós-doutorado, em Berna, na Suiça.

Neste estudo realizado em caprinos experimentalmente infectados com o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) durante oito anos e apresentando diferentes cargas virais, foi possível abordar aspectos relacionados à persistência do vírus no organismo através da PCR em tempo real. Demonstrou-se que os animais apresentavam cargas virais distintas, provavelmente vinculadas a uma resposta imune distinta. Apesar das diferentes cargas virais, foi possível detectar a presença do vírus em pelo menos um linfonodo de todos os animais infectados. Os linfonodos, ou nódulos linfáticos, desempenhariam um possível papel de "reservatório" (reservoir) do CAEV nos animais com baixa carga viral, indetectável no sangue.

Para fins de otimização no diagnóstico molecular, observou-se que a maior carga viral foi detectada nas células do leite, indicando que a utilização de amostras de leite pode dar resultados superiores aos encontrados em amostras de sangue.

O workshop veio contribuir para as pesquisas que estão sendo realizadas no diagnóstico da CAE, essenciais para a implementação de um programa de controle da infecção de pequenos ruminantes pelos lentivírus.