Este texto é a parte da palestra apresentada pelo Dr. Bridges da Universidade de Minnesota, no XVII Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos, realizado em Uberlândia de 14 e 15 de março de 2013.

Efeito das concentrações de progesterona durante o desenvolvimento folicular sobre a competência do ovócito

Recentemente, começou-se a pesquisar a influência das concentrações de progesterona durante o desenvolvimento folicular sobre a competência do ovócito. A redução das concentrações circulantes de progesterona durante a onda folicular pode proporcionar maior suporte gonadotrófico ao folículo ovulatório (Robinson et al., 1989; Dias et al., 2009) e maior produção folicular de estradiol (Sirois e Fortune, 1990), além de afetar diretamente a maturação e a competência do ovócito (Driancourt et al., 1998; van de Leemput et al., 1998). Conforme demonstrado previamente, ovócitos bovinos obtidos a partir de folículos pré-ovulatórios com concentrações mais altas de estradiol têm maior probabilidade de desenvolvimento até o estágio de blastocisto in vitro (van de Leemput et al., 1998). Além disso, a inibição dos pulsos de LH e o declínio subsequente da produção folicular de estradiol reduzem a proporção de ovócitos ovinos que sofre clivagem e atinge o estágio de blastocisto (Oussaid et al., 1999). Dado o papel do LH na maturação do ovócito (Savio et al., 1993; Gong et al., 1995) e a sua capacidade de inibir a produção de estradiol pelo folículo dominante (Schallenberger et al., 1984), o aumento da pulsatilidade de LH através da redução das concentrações de progesterona pode favorecer a competência do ovócito. Isso motivou a realização de dois experimentos, ambos envolvendo novilhas de corte Bos taurus e voltados para a determinação da influência das concentrações circulantes de progesterona sobre a dinâmica folicular e a competência do ovócito. A punção folicular (OPU) transvaginal guiada por ultrassom foi empregada para coletar ovócitos de fêmeas com diferentes concentrações de progesterona. Em seguida, os ovócitos foram avaliados quanto à qualidade e capacidade de se diferenciar em blastocisto após a produção de embriões in vitro (PIV). A hipótese era que a redução das concentrações de progesterona durante o crescimento folicular resultaria em aumento da concentração de LH, promovendo o desenvolvimento de um ovócito mais competente, com maior probabilidade de diferenciação em blastocisto.

O primeiro experimento foi realizado com novilhas de sobreano da raça Charolês (n = 36). Todas as novilhas foram pré-sincronizadas para apresentar estro no mesmo dia do ciclo estral (estro = dia 0) e alocadas para um dos seguintes tratamentos: 1) progesterona alta (H) ou 2) progesterona baixa (L). A ablação folicular foi realizada no dia 5,5 para reiniciar e padronizar o crescimento folicular. Imediatamente após a punção, as novilhas do grupo de tratamento L receberam um CIDR usado e duas injeções de 25 mg de PGF, com um intervalo de 6 a 8 horas, para a indução da luteólise. Consequentemente, a única progesterona presente na circulação no grupo de tratamento L era proveniente do CIDR usado. No momento da ablação folicular, as novilhas do grupo de tratamento H receberam um CIDR novo e não receberam PGF. O crescimento folicular foi estimulado pela administração de 40 mg de FSH nos dias 7,5, 8, 8,5 e 9 e os ovócitos foram coletados por OPU de todos os folículos visíveis no dia 10,5. Após a OPU inicial, as novilhas receberam outro CIDR novo (grupo de tratamento H) ou usado (grupo de tratamento L) e receberam nova injeção de 40 mg de FSH nos dias 12,5, 13, 13,5 e 14 para estimular o crescimento folicular. Uma segunda OPU foi realizada no dia 15,5 para a coleta de ovócitos de todos os folículos visíveis. As concentrações circulantes de progesterona foram avaliadas durante todo o ensaio e, no momento da OPU, o número de folículos aspirados foi registrado. Os ovócitos coletados foram imediatamente transportados para o laboratório e classificados.

Conforme esperado, durante o crescimento folicular as concentrações de progesterona diferiram (P < 0,01) entre os tratamentos a cada coleta realizada após a ablação. As novilhas do grupo de tratamento L produziram número maior de folículos (P = 0,03) e apresentaram maior número de ovócitos recuperados (P = 0,02) do que as novilhas do grupo de tratamento H. Além disso, o número de ovócitos de grau 1 a 3 por animal (P = 0,02) foi maior nas novilhas do grupo de tratamento L do que nas novilhas do grupo de tratamento H.

O segundo experimento foi realizado com vacas Angus adultas (n = 56). O delineamento experimental foi semelhante ao empregado no experimento 1, exceto pelo objetivo adicional de comparar os efeitos das concentrações de progesterona sobre a qualidade do ovócito, com ou sem emprego de FSH para induzir o crescimento folicular. Para esse fim, todas as vacas foram sincronizadas para apresentar estro no mesmo dia do ciclo estral (estro = dia 0), a ablação folicular foi empregada para reiniciar as ondas foliculares (dia 5,5) e o estímulo ovariano com 40 mg de FSH foi realizado nos dias 7,5, 8, 8,5 e 9, antes da coleta de todos os folículos visíveis por OPU no dia 10,5. A segunda onda de crescimento folicular não foi estimulada com FSH e, consequentemente, a OPU foi realizada no dia 14,5, 4 dias após a OPU anterior. Portanto, neste experimento foi empregado o delineamento fatorial 2x2, tendo como efeitos principais a concentração de progesterona (L ou H) e FSH (sim/não). No experimento 2, todos os ovócitos coletados com sucesso foram submetidos à produção in vitro de embriões (PIV), que permitiu a avaliação da taxa de clivagem e de formação de blastocistos, além da inspeção da qualidade do embrião. A microscopia epifluorescente também foi empregada na determinação do número total de blastômeros e do número de blastômeros mortos.

Conforme esperado, as concentrações de progesterona diferiram (P < 0,01) entre os tratamentos a cada coleta após a ablação. A redução das concentrações de progesterona durante o desenvolvimento folicular resultou em um maior número de folículos no momento da OPU, independente da administração de FSH. Entretanto, as concentrações de progesterona não influenciaram o número de ovócitos recuperados, a qualidade desses ovócitos à inspeção ou a sua capacidade de clivagem e desenvolvimento até o estágio de blastocisto após a PIV. Embora a produção de blastocistos não tenha sido afetada pela concentração de progesterona, os embriões em estágio de blastocisto derivados de ovócitos coletados de vacas com baixas concentrações de progesterona apresentaram desenvolvimento mais avançado (P < 0,05), com maior número total de células (P < 0,05) do que os embriões em estágio de blastocisto derivados de ovócitos coletados de vacas expostas a altas concentrações de progesterona. Com relação ao segundo objetivo, o número de folículos (P ˂ 0,001) e o número de ovócitos recuperados (P ˂ 0,001) foram maiores nas vacas tratadas com FSH. Além disso, a administração de FSH resultou em um número maior de ovócitos de grau 1 a 3 por vaca (P ˂ 0,001), com tendência (P = 0,06) ao aumento da porcentagem de ovócitos de grau 1 a 3 por vaca.

Em ambos os experimentos, 1 (novilhas) e 2 (vacas), a baixa concentração de progesterona durante o desenvolvimento folicular resultou em aumento do número de folículos ovarianos no momento da OPU. Não se sabe ao certo qual o motivo desse aumento, mas é possível que a queda dos níveis de progesterona tenha resultado em maior desenvolvimento folicular devido ao aumento da liberação de FSH, permitindo o recrutamento de maior número de folículos, ou que a baixa concentração de progesterona tenha levado ao aumento da secreção de LH, com redução do número de folículos atrésicos após o recrutamento. O aumento do número de ovócitos de grau 1 a 3 observado nas novilhas que receberam baixas doses de progesterona refletiu mais em maior número de folículos presentes no ovário no momento da OPU do que a melhora da qualidade dos ovócitos coletados devido às baixas concentrações de progesterona, uma vez que a proporção de ovócitos de grau 1 a 3 entre o todos os ovócitos coletados não diferiu entre os tratamentos em nenhum dos dois estudos. Embora tal resultado não reforce a hipótese de que a baixa concentração de progesterona melhore a qualidade do ovócito, o dado é importante do ponto de vista prático, uma vez que maior número total de ovócitos de grau 1 a 3 é desejável quando se realiza OPU.

No experimento 2, a taxa de clivagem do ovócito e de desenvolvimento de blastocistos não foi influenciada pela concentração de progesterona, o que pode em parte refletir as limitações inerentes ao emprego da PIV para mensurar a competência do ovócito. Neste estudo, todos os ovócitos coletados foram submetidos à PIV e as práticas características de produção envolvidas limitam os ovócitos aos graus 1 a 3, uma vez que ovócitos de graus 4 a 6 apresentam taxas de formação de blastocistos entre 0 e 6% (Blondin et al., 1996). A inclusão de todos os ovócitos foi realizada para evitar vieses caso houvesse diferença no grau de qualidade dos ovócitos entre os tratamentos. Embora a taxa de clivagem e de formação de blastocistos não tenham diferido entre os tratamentos, os embriões derivados de vacas do grupo de tratamento com baixos níveis de progesterona apresentaram estágio mais avançado de desenvolvimento e maior número de células no dia 7, o que pode refletir melhora na qualidade dos ovócitos das fêmeas do grupo de tratamento de baixa progesterona. Apesar do baixo número de estudos envolvendo comparações semelhantes, Chaubal et al. (2007), empregando um modelo animal semelhante ao descrito e vacas tratadas com LH antes da OPU, relataram que os ovócitos das vacas que não receberam CIDR geraram quase o dobro do número de blastocistos do que os ovócitos das vacas que receberam CIDR. Apesar das diferenças de resultados, isso reforça a idéia de que ambientes pobres em progesterona antes da OPU e durante o desenvolvimento folicular possam melhorar a qualidade do ovócito e aumentar o número de blastocistos gerados. Além disso, no estudo de Chaubal et al. (2007), o número de folículos aspirados e ovócitos coletados não diferiu entre as vacas que receberam ou não CIDR. Portanto, o maior número de blastocistos gerados após a PIV provavelmente refletiu a melhor qualidade dos ovócitos das vacas que não receberam CIDR. Os motivos por trás das diferenças entre os resultados deste estudo e do estudo de Chaubal et al. (2007) não foram esclarecidos e novas pesquisas voltadas para a investigação direta do papel das concentrações de progesterona e de gonadotrofinas na qualidade do ovócito se fazem necessárias.

Do ponto de vista prático, os resultados desses experimentos têm implicações na PIV e na transferência de embriões. Em bovinos, embriões produzidos in vitro são mais baratos do que embriões produzidos in vivo e são requisitados tanto para uso em vacas de corte como em vacas leiteiras. Além disso, a transferência de embriões produzidos in vitro que não submetidos ao congelamento resulta em taxas aceitáveis de prenhez (53,8%, 1.220/2.268; Hasler et al., 1995). Segundo os relatos da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões, o número total de embriões bovinos viáveis produzidos in vitro aumentou no mundo todo desde 2000 (Stroud, 2010), com crescimento de 19,7% entre 2009 e 2010. Espera-se que o número de transferências de embriões produzidos in vitro continue a crescer, acompanhando a evolução das tecnologias de OPU e PIV. Consequentemente, os resultados deste estudo podem afetar o manejo das doadoras submetidas à OPU. Em bovinos de corte, pode ser melhor desenvolver protocolos de OPU que promovam um perfil endócrino com baixos níveis de progesterona durante o desenvolvimento da onda folicular. Os resultados de Chaubal et al. (2007) sugerem que tal abordagem pode aumentar o número de ovócitos recuperados e a produção e/ou qualidade dos blastocistos gerados. Novas pesquisas se fazem necessárias para confirmar tais especulações. Além disso, o Brasil é líder na área de PIV e transferência de embriões, respondendo por quase 80% das atividades mundiais relacionadas à PIV. Os resultados descritos se referem a bovinos Bos taurus, porém acredita-se que resultados semelhantes possam ser obtidos em bovinos Bos indicus e mereçam ser investigados, uma vez que os procedimentos de OPU e PIV são empregados com maior frequência nesses animais.